大阪大学大学院医学系研究科 ゲノム生物学講座 遺伝子治療学分野
Division of Gene Therapy Science, Department of Genome Biology, Graduate School of Medicine, Osaka University.
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研究内容紹介
Ⅰ.癌細胞の特性の解明とそれに基づく分子治療法の開発

我々は不活性化したセンダイウイルス粒子をもとにし遺伝子やsiRNAを導入できるベクターであるHVJ envelope vector (HVJ-E)を開発した(図1)。このベクターにより、様々な培養細胞や組織細胞への遺伝子導入やドラッグデリバリーが可能になった。近年、我々は、HVJ-E ベクターそれ自身に抗腫瘍効果をもつことを見出した(図2)。この分子機構の解明は、腫瘍細胞の特性の解明につながり、ひいてはがん制圧の新たな戦略を提唱できるものである。HVJ-Eを用いた臨床研究は大阪大学医学部附属病院でメラノーマ、前立腺癌を対象として行われ、その結果を基に、現在、悪性胸膜中皮腫を加えて医師主導治験が行われ、薬事申請を目指している。

1)多彩な抗腫瘍免疫の活性化機構
HVJ-Eは腫瘍細胞や樹状細胞、マクロファージなどからのケモカイン産生誘導によって、NK細胞やCD4+, CD8+ T cellを腫瘍巣に引き寄せ、Th1優位な形質転換を誘導し、NK細胞やEffector T cellの抗腫瘍効果を高めることが分かってきた(Cancer Res. 2007)(図2)。さらにこれらT細胞免疫を抑制する制御性T細胞をIL-6の分泌を介して抑制し(FEBS Lett. 2008)、最終的に抗腫瘍活性を高め維持することができる。この抗腫瘍免疫には、腫瘍微小環境のマクロファージや好中球にHVJ-Eが作用して、腫瘍促進生の細胞を抗腫瘍性に形質転換し、それらがeffector T cellの遺伝子発現をコントロールし、腫瘍細胞傷害性T細胞としての機能を高めることがわかってきた(Oncotarget 2016)。現在、免疫チェックポイントに対する抗体療法が癌治療に用いられ有望な結果が得られているが、この治療法に抵抗性の癌に対して、作用機序の異なるHVJ-Eは抗腫瘍効果を補完できる可能性が高い。現在、さらに抗腫瘍効果を増強できるシグナル経路の探索とその新たな制御機構の研究を進めている。その成果をもとに今後はHVJ-Eを用いた新たな癌遺伝子治療の開発を行う。
2)癌細胞選択的な細胞死誘導
HVJ-Eは前立腺癌やグリオーマなどのヒト癌に対して選択的な細胞死を誘導する。HVJの受容体のgangliosideは多くの癌細胞で高発現が認められ(Int. J. Cancer 2010)、このレセプターを発現した癌細胞は、HVJ-Eのみで細胞死が誘導される。正常細胞も受容体を発現しているが細胞死は誘導されない。そのメカニズムはウイルスRNAゲノム断片が細胞内核酸受容体によって認識されて活性化されるシグナルによる癌細胞選択的なアポトーシス誘導であることがわかった(Clinical Cancer Res. 2012)(図1)。我々は最近その構造を明らかにしている(Mol. Therapy 2016)。しかしCaspase 8の欠損した神経芽腫細胞では細胞融合時の細胞質内カルシウムの上昇によってCaM-kinase IIが活性化されプログラム化されたNecroptosisが起こることを発見した(Cancer Res. 2015)。現在は、アポトーシス誘導因子の発現が何故癌細胞選択的に発現するのか、それら遺伝子のエピゲノム状態はどのようになっているのかを解明している。また最近注目されているゲノム編集法であるCRISPR/Cas9を用いて、網羅的に遺伝子をノックアウトしてHVJ-Eに抵抗性の癌細胞を分離して、癌細胞死に関与している遺伝子の全貌を明らかにしようとしている。
3)腫瘍組織へのDDSの開発
我々はHVJ-Eの膜たんぱく質を改変する事によって標的化や高機能化を可能にするベクターの開発を行ってきた(図3)(Human Gene Ther. 2007, Clinical Cancer Res. 2013)。最近、腫瘍組織中に微小出血が多数起こり血小板凝集がみられること、血小板を活性化できるトロンビンの活性が高いことを見出し、それをもとに血小板ベクターを開発した(図4)。HVJ-EやケモカインIP-10を封入した血小板はマウスの腫瘍モデルにおいて、腫瘍組織に特異的に集積し、HVJ-EやIP-10を放出して抗腫瘍効果を発揮した(Mol. Therapy 2014, Scientific Reports 2016)。現在、癌転移モデルでの効果を検証している。また最近、遺伝子を用いて癌細胞由来のExosomeの機能を改変できる技術を開発した。癌細胞由来Exosomeが抗腫瘍免疫を活性化して抗腫瘍効果を発揮できるようになった。免疫活性化作用を持つDDSとなる可能性を追求している。
4)癌幹細胞の特性の解明
固形腫瘍における癌幹細胞の同定自体は依然として難しく、少なくとも造血幹細胞と同じようには議論できないが、Cancer-initiating cellというような集団が癌細胞集団の中に存在し、それらが治療抵抗性の形質を賦与していることについてはエビデンスが集積されてきている。抗癌剤耐性となる機構については、トランスポーターなどの遺伝子の過剰発現などが指摘されてきているが、実際には様々な治療に抵抗性を示すため、もっと本質的な遺伝子発現の異常が関与していることが示唆される。我々は癌細胞が抗癌剤によって受けるストレスが、ERK1/2, CXCR4, c-mycをそれぞれ活性化し、さらにpositive feedback loopが構築され腫瘍形質の増強を起こすことを報告した(Mol. Cancer Res. 2013)。Nanog遺伝子の発現がその抗癌剤耐性に関与することもゲノム編集技術を用いて解明した(Oncotarget 2015)。現在、CRISPR/Cas9を利用した網羅的な遺伝子ノックアウト法によって癌幹細胞の形質を解明する研究も着手している。一方、癌幹細胞が宿主免疫系を回避できるメカニズムについては、従来全く未解明であったが、それを示唆するデータも得られてきている。今後、これらの研究の一層の充実を図る予定である。
図1:HVJ envelope vector. Plasmid DNA, siRNA, protein, 抗癌剤等を封入し、膜融合により細胞質内に直接導入することができる。様々な培養細胞や生体組織での導入が可能。
図2:不活性化センダイウイルス粒子であるHVJ-Eは多彩な抗腫瘍作用を有し、新規抗がん剤となりうる。また将来は遺伝子治療にも応用可能である。
図3:HVJ-Eを改良し、一本鎖IL-12を結合させた高機能化HVJ-Eを開発した。癌細胞に対するキラーT細胞の活性増強が認められる。静脈注入により肺に集積するため、マウスメラノーマの肺転移巣を抑制した。
図4:HVJ-Eを封入した血小板ベクターは全身投与によって、腫瘍組織に集積し、そこで活性化されてHVJ-Eを放出する。HVJ-Eは血管内皮や腫瘍細胞に作用して、抗腫瘍免疫を活性化し、癌細胞選択的な細胞死を誘導し、腫瘍を抑制する。
最近の主要論文業績(2012〜2016年)
  1. Nimura K, Yamamoto M, Takeichi M, Saga K, Takaoka K, Kawamura N, Nitta, H, Nagano H, Ishino S, Tanaka T, Schwarz RJ, Aburatani H, Kaneda Y. Regulation of alternative polyadenylation by Nkx2-5 and Xrn2 during heart development. eLife, in press.
  2. Chang CY, Tai JA, Li S, Nishikawa T, Kaneda Y. Virus-stimulated neutrophils in the tumor microenvironment enhance T cell-mediated anti-tumor immunity. Oncotarget in press.
  3. Jiang Y, Saga K, Miyamoto Y, Kaneda Y. Cytoplasmic calcium increase via fusion with inactivated Sendai virus induces apoptosis in human multiple myeloma cells by downregulation of c-Myc oncogene. Oncotarget in press.
  4. Li, Y-T., Nishikawa, T., and Kaneda, Y. Platelet-cytokine Complex Suppresses Tumour Growth by Exploiting Intratumoural Thrombin-dependent Platelet Aggregation. Scientific Reports, 2016 Apr 27;6:25077.
  5. Liu, L-W, Nishikawa, T. and Kaneda, Y. An RNA molecule derived from Sendai virus DI particles induces anti-tumor immunity and cancer-selective apoptosis. Mol. Therapy, 24(1):135-45, 2016.
  6. Kawamura, N., Nimura, K., Nagano, H., Yamaguchi, S., Nonomura, N. and Kaneda, Y. CRISPR/Cas9-mediated gene knockout of NANOG1 and NANOGP8 leads to low malignant potential in prostate cancer. Oncotarget, Sep 8;6(26):22361-74, 2015.
  7. Gerardo Rodriguez-Araujo, Hironori Nakagami, Yoichi Takami, Tomohiro Katsuya, Hiroshi Akasaka, Shigeyuki Saitoh, Kazuaki Shimamoto, Ryuichi Morishita, Hiromi Rakugi, and Yasufumi Kaneda "Low Alpha synuclein levels in the blood are associated with insulin resistance"
    Scientific Reports Jul 10;5:12081, 2015.
  8. Iinuma S, Aikawa E, Tamai K, Fujita R, Kikuchi Y, Chino T, Kikuta J, McGrath J, Uitto J, Ishi M, Iizuka H and Kaneda Y. Transplanted bone marrow-derived circulating PDGFRα+ cells restore type VII collagen in recessive dystrophic epidermolysis bullosa mouse skin graft. J. Immunology, 194, 1996-2003, 2015.
  9. Fujita R, Tamai K, Aikawa E, Nimura K, Ishino S, Kikuchi Y, Kaneda Y. Endogenous Mesenchymal Stromal Cells in Bone Marrow are Required to Preserve Muscle Function in Mdx Mice. Stem Cells. 33, 962-975, 2015.
  10. Fei, Y., Nimura, K., Lo, W-N, Saga, K., Kaneda, Y. Histone H3 lysine 36 methyltransferase Whsc1 promotes the association of Runx2 and p300 in the activation of bone-related genes. PLOS-ONE, Sep 4;9(9):e106661, 2014.
  11. Nishikawa, T., Tung L-Y, Kaneda, Y. Systemic administration of platelets incorporating inactivated Sendai virus eradicates melanoma in mice. Mol. Therapy, 22(12):2046-55, 2014.
  12. Nomura, M., Ueno, A., Saga, K., Fukuzawa, M. and Kaneda, Y. Accumulation of cytosolic calcium induces necroptotic cell death in human neuroblastoma. Cancer Res. 74, 1056-1066, 2014.
  13. Hatano, K., Yamaguchi, S., Nimura, K., Murakami, K., Nagahara, A., Fujita, K., Uemura, M., Nakai, Y., Tsuchiya, M., Nakayama, M., Nonomura, N., and Kaneda, Y. Residual prostate cancer cells after docetaxel therapy increase the tumourigenic potential via constitutive CXCR4, ERK1/2 and c-Myc signalling loop activation. Mol. Cancer Res., 11:1088-100. 2013.
  14. Takeichi M, Nimura K, Mori M, Nakagami H, Kaneda Y. The Transcription Factors Tbx18 and Wt1 Control the Epicardial Epithelial-Mesenchymal Transition through Bi-Directional Regulation of Slug in Murine Primary Epicardial Cells. PLoS One. 2013;8(2):e57829.
  15. Saga, K., Tamai, K., Yamasaki, T., and Kaneda, Y. Systemic administration of a novel immune-stimulatory pseudovirion suppresses lung metastatic melanoma by regionally enhancing IFN-γ production. Clinical Cancer Research., 1;19(3):668-79, 2013.
  16. Nomura, M., Shimbo, T., Miyamoto, Y., Fukuzawa, M. and Kaneda, Y. 13-cis retinoic acid can enhance the anti-tumor activity of non-replicating Sendai virus particle against neuroblastoma. Cancer Science, 104(2):238-44, 2013.
  17. Gerardo Rodriguez-Araujo, G., Nakagami, H., Hayashi, H., Mori, M., Shiuchi, T., Minokoshi, Y., Nakaoka, Y., Takami, Y., Komuro, I., Morishita, R., and Kaneda, Y. Alpha-synuclein elicits glucose uptake and utilization in adipocytes through the Gab1/PI3K/Akt transduction pathway. J. Cellular and Molecular Life Sciences, 70(6):1123-33, 2013.
  18. Matsushima-Miyagi, T., Hatano, K., Nomura, M., Li-Wen, L., Nishikawa, T., Saga, K., Shimbo, T. and Kaneda, Y. TRAIL and Noxa are selectively up-regulated in prostate cancer cells downstream of the RIG-I/MAVS signaling pathway by non-replicating Sendai virus particles. Clinical Cancer Research, 18, 6271-83, 2012.
  19. Mori, M., Nakagami, H., Rodriguez-Araujo, G., Nimura, K. and Kaneda, Y. Essential role for miR-196a in brown adipogenesis of white fat progenitor cells. PLoS Biology, Apr;10(4):e1001314, 2012.
  20. Hayashi, H., Nakagami, H., Takeichi, M., Shimamura, M., Koibuchi, N., Oiki, E., Sato, N., Koriyama, H., Gerardo-Araujo, R., Maeda, A., Morishita, R., Tamai, K., and Kaneda, Y. HIG1, a novel regulator of mitochondrial γ-secretase, maintains normal mitochondrial function. The FASEB J. 26(6):2306-17, 2012.
  21. Hatano, K., Miyamoto, Y., Mori, M., Nimura, K., Nakai, Y., Nonomura, N., and Kaneda, Y. Androgen-Regulated Transcriptional Control of Sialyltransferases in Prostate Cancer Cells. PLoS ONE, 2012;7(2):e31234.
  22. Kiyohara, E., Tamai, K., Katayama, I., Kaneda, Y. The combination of chemotherapy with HVJ-E containing Rad51 siRNA elicited diverse anti-tumor effects and synergistically suppressed melanoma. Gene Therapy, 19, 731-41, 2012.
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