平成１２年度研究計画

研究項目Ａ０１：抗原非特異的分子による情報伝達制御

計画研究ア：サイトカイン、接着分子の情報伝達制御

○ 1. 平野俊夫：gp130を介するシグナル伝達制御と免疫応答(阪大院・医・バイオ・教授・免疫学)

2. 竹田　潔：炎症反応を制御するマクロファージ内シグナル伝達の機構解析(阪大・微研、助手・免疫学)

３．熊ノ郷 淳：CD40リガンド及びCD100を介した免疫応答制御機構(阪大・微研、助手・免疫学)

４. 宮坂昌之：CD44/L-セレクチンによる免疫制御(阪大院・医・バイオ・教授・免疫学)

５. 高津聖志：IL-5/CD38によるクラススイッチ機構(東大・医科研・教授・免疫学)

６. 瀧　伸介：IRF-1/IRF-2による免疫制御機構(東大院・医・講師・免疫学)

７. 吉村昭彦：CISファミリーによるサイトカインシグナル制御機構(久留米大・分子生命科学研・教授・免疫学)

目的

計画

業績

インパクトファクター

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研究目的

抗原受容体を介する第１シグナルにより抗原特異的に選択されたリンパ球クローンの運命、すなわち、細胞増殖、機能分化、死、は第１シグナルと、サイトカイン等の抗原非特異的分子の受容体を介する第２シグナルとのクロストークにより決定される。またこれらの抗原非特異的分子はリンパ節などの免疫臓器の構築や、リンパ球の初期発生、リンパ球の遊走、ホーミングにも重要な役割を担っている。このような抗原非特異的シグナルに関与するサイトカイン、ケモカイン、補助受容体、接着分子とその受容体の構造と機能や、細胞内情報伝達を分子のレベルで解明することを目的とする。また、これらの分子の欠損マウスや変異分子発現マウスを作成することにより、あるいは、これらのマウスを交配することにより、生体内でのこれら分子の免疫応答における役割や、その異常によって生じる各種の免疫異常の発症機構を明らかにすることを目的とする。平野はIL-6受容体のシグナル伝達性サブユニットであるgp130をモデルとしてサイトカイン受容体を介して細胞の増殖分化がどのようにして制御されているかを解明してきた。その結果gp130の細胞内ドメインより少なくとも３種のシグナルが誘導されることを明らかにしている。すなわち、JAKを介する直接のシグナル、SHP-2、Gabファミリーを介するMAPKのシグナル、及びSTAT3を介するシグナルである。これらのシグナルが細胞の増殖、分化、死の制御に重要な役割を果たしていることを明らかにしてきた。また、Gab1と同様の機能を有するGab2を同定し、Gab1, Gab2ファミリー蛋白がgp130のみならず多くのサイトカイン・成長因子の下流で働くこと、T・B細胞の抗原受容体の刺激によってもリン酸化されることから抗原受容体シグナル伝達にも関与している可能性を見いだした。本研究ではさらに、gp130を介するシグナル伝達を解明する努力を行なうとともに、その免疫応答における役割を明らかにする。瀧は転写抑制因子IRF-2欠損マウスにおいて自然発症するヒト乾癬に類似した皮膚疾患について、その発症がインターフェロン誘導遺伝子の異常発現およびそれに起因するCD8+ T細胞の異常活性化に依存することを明らかにしてきた。本研究では、皮膚疾患発症へとつながるこの一連のプロセスを、そこに関与する分子・遺伝子を同定する事を通じて明らかにする。マクロファージは、自然免疫系において外界異物の侵入を最初に認識し炎症反応を誘発するとともに、獲得免疫系を活性化させることにより、生体防御反応の中心的役割をになっている。しかしながらこれらの反応の分子機構は不明な点が多い。そこで、竹田はマクロファージのシグナル伝達に関わる分子に着目し、マクロファージの機能を生体レベルで解析する。特に外界異物の認識に関わるToll-like receptorファミリーからのシグナルによる自然免疫の外界異物認識機構、さらにはサイトカインシグナル伝達分子によるマクロファージの活性制御の分子メカニズムを解析し、マクロファージによる免疫応答の制御機構を解明することを目的とする。一方免疫応答の負の制御機構を明らかにすることは免疫応答の制御機構を解明するためには重要である。吉村はサイトカインシグナルの負の調節因子であるCIS/JABファミリーを見い出した。本研究では、JABによるT細胞抑制の分子機構やTh1/Th2分化への役割を明かにする。IL-5はB-1細胞の発生や増殖を促すのみならず、IgMやIgA産生を促進する。さらに、活性化されたB-2細胞に作用しm鎖からg1鎖へのアイソタイプ変換を誘導するが、その分子機構やシグナル伝達の制御機構は不明の点が多い。高津はIL-5によるB細胞分化機構、とりわけIgアイソタイプ変換の機構を明らかにする。B細胞上に発現するCD40分子と活性化T細胞上に発現するCD40リガンドの相互作用は免疫応答に必須である。熊ノ郷はCD40-CD40リガンド相互作用によるT細胞の自己反応性制御機構、さらにはCD40刺激によりB細胞上に誘導されるCD100を介した免疫応答成立機構の解析を行う。CD100はセマフォリンファミリーの中で唯一免疫系に発現することが知られている分子であり、熊ノ郷はこれまでにCD40刺激によりB細胞に誘導される分子としてCD100を同定するとともにそのレセプターがCD72であることを明らかにした。本研究から、抗体のクラススイッチや、胚中心形成のメカニズムの解明,さらには免疫系と神経系のクロストークが明らかとなると考えられる。免疫反応および免疫記憶の成立には、局所リンパ組織でのリンパ球の感作と全身への感作リンパ球の伝播が必要である。このプロセスにはリンパ球上の接着分子であるL-selectinとCD44が重要な役割をすることが示唆されてきたが、実際にどのようなリガンドを認識してその機能が果たされるかは不明な点が多かった。宮坂はL-selectinとCD44が共通に認識する新規リガンドとしてコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの一つversicanがあり、これらの分子間相互作用にはversican上の糖鎖構造が重要であることを明らかにした。さらにこの糖鎖構造には、主に単核球に働くケモカインが選択的に結合することを明らかにしている。本研究ではこれらの分子群が免疫反応においてどのような役割を果たすのかについて免疫制御という観点から明らかにすることを試みる。このように、本研究は、免疫応答に関する第二シグナルに焦点をあてて、分子レベル、細胞レベル及び個体レベルで、第二シグナルに関与する分子の作用機構と、免疫応答における役割、及び免疫異常への関与を明らかにしようとするものであり、多大な成果が期待される。この分野に関与する国内でのトップクラスの研究者より組織されおり、国際的にもリードしうる立場にある。

研究計画

平野：シグナル特異的変異gp130ノックインマウスはすでに作成済みである。SHP-2を活性化出来ない変異gp130を発現しているノックインマウスでは、クラススイッチ、抗体産生細胞への分化などの亢進が認められる。さらに脾腫やリンパ節腫脹が認められる。またSTAT3シグナルの亢進が認められる。このことはSHP-2がgp130シグナルを負に制御していることを示している。このノックインマウス由来B細胞を分離し、gp130を介するクラススイッチの分子機構、抗体産生細胞への分化に関与する分子の同定を行う。また脾腫、リンパ節腫脹の機構の解明と、これらのマウスにおける自己免疫疾患等の免疫異常の発症の可能性を検討する。p40Tax トランスジェニックマウスに発症するリウマチ様の関節炎はIL-6依存性であることが明らかになっているが、gp130のどのシグナル伝達経路が関係しているかを明らかにするためにシグナル特異的変異gp130ノックインマウスとp40Taxトランスジェニックマウスとの交配実験を行う。Gab1ノックアウトマウスは胎生致死であるので、胎生１４日の肝臓細胞を使用して再構成マウスを作製し免疫細胞の初期分化や、免疫応答におけるGab1の役割を明らかにする。またGab2ノックアウトマウスを作成する。

瀧：I型IFNの本疾患発症への関与について、CD8+T細胞の異常活性化に関わるいかなるIFN誘導遺伝子が高発現しているのかを、differential display等のテクニックを用いて同定する。同定された遺伝子の欠損マウスが入手可能な場合には、交配を通じて、その発症への関わりを検証し、入手不可能な場合にはin vitroの機能検定系を用いるなどしてその機能を検定する。異常活性化CD8+T細胞が、いかなる機構で、本皮膚疾患を引き起こすのかを個体レベルで検討する。BALB/c背景遺伝子が、遺伝子発現、CD8+T細胞の活性化、炎症のいずれのレベルにおいて疾患感受性を制御しているのかを、それぞれのレベルのパラメータをC57BL/6背景を持つマウスと比較し検討する。このマウスで見られるTh2シフトと、CD8+T細胞異常および皮膚疾患の関係を検討するために、Th2分化に異常を持つマウス（Stat6欠損マウス等）との掛け合わせや、IL-12、抗IL-4抗体の投与などを試みる。

竹田：マクロファージで、IL-10により誘導される遺伝子をサブトラクション法により同定する。その遺伝子のうちSTAT3欠損細胞で発現が減少している遺伝子を、マクロファージに発現させ、LPSによるサイトカイン産生を指標に機能抑制に働く遺伝子を検索する。LPS以外の種々の菌体成分（グラム陽性球菌やマイコバクテリウム由来の成分など）へのMyD88ノックアウトマウスの反応性を検討し、外界異物認識におけるMyD88の役割を解析する。TLRファミリーのノックアウトマウスを作製する。

吉村：ＪＡＢ-/-ではT細胞が活性化されている。ＪＡＢがＣＤ２８の機能を抑制する可能性について検討する。まずＪＡＢがリン酸化CD２８細胞内ドメインと会合するかどうか、するとすればどのチロシン残基と会合するか決定する。ＪＡＢの強制発現によってT細胞抗原受容体やCD２８の機能を抑制できるかどうか、IL2産生、細胞増殖を指標にトランスジェニックマウス、ノックアウトマウスのT細胞やJAB遺伝子およびその変異体を導入したJurkat細胞で解析を行う。APSはB細胞抗原受容体やc-kitによってチロシンリン酸化されるが、強制発現によってエリスロポエチンやPDGFのシグナルを抑制することを明かにしている。ＡＰＳはLnk、SH2-Bとファミリーをつくる。現在Lnk,APSのノックアウトマウスは高木らによって解析中なので我々はSH2-Bのノックアウトを作成し、免疫系での異常を調べる。

高津： IL-5がIgG1へのアイソタイプ変換を選択的に惹起するのかを明らかにするため、抗CD38抗体のみならず、抗CD40抗体や抗IgD-dexでナイーブB細胞を刺激し、IgG1以外のアイソタイプ産生が惹起されるか、CH遺伝子の組み替えがおこるのかを検索する。またIL-5によるIgG1へのアイソタイプ変換にKu70 / Ku80複合体やDNA-PKの活性化などのDNA修復系が関与するかを検討する。

熊ノ郷： CD40シグナルの標的遺伝子産物の一つであるCD100は、同じくB細胞に発現するCD72に結合し抗体のクラススイッチを促進させる。そのメカニズムを明らかにするためCD100刺激によるB細胞内のシグナル伝達経路を明らかにする。 CD100をB細胞で過剰発現するマウス及びCD100欠損マウスの表現型及び免疫応答能を解析する。自己免疫疾患モデルマウスであるMRL/lprにおける血中の分泌型CD100を測定することにより自己免疫疾患におけるCD100の病的意義を明らかにする。CD40を欠損した抗原提示細胞に種々のサイトカインを補充してやることにより障害されていたT細胞のTh1細胞への分化をレスキューできるか否かを検討する。

宮坂： CD44、L-selectinの新規リガンドであるversicanの糖鎖構造の解明と同構造に対する特異的モノクローナル抗体の作成。上記抗体を用いてL-selectin、CD44結合性糖鎖構造がin vivoでの免疫反応においてどのように発現するかを時間的、空間的に明らかにする。糖鎖構造の構造的解析によりケモカイン結合に関する要求性を明らかにする。

研究業績

平野俊夫

1. Shirogane, T., T. Fukada, J.M.M. Muller, D. T. Shima, M. Hibi, and T. Hirano, Synergistic roles for Pim-1 and c-Myc in STAT3-mediated cell cycle progression and anti-apoptosis. Immunity 11, 709-719, 1999.

2. Kiuchi, N., K. Nakajima, M. Ichiba, T. Fukada, M. Narimatsu, K. Mizuno, M. Hibi, and T. Hirano. STAT3 is required for the gp130-mediated full activation of the c-myc gene. J. Exp. Med. 189: 63-73, 1999

3. Fukada, T., T. Ohtani, Y. Yoshida, T. Shirogane, K. Nishida, K. Nakajima, M. Hibi, and T. Hirano. STAT3 orchestrates contradictory signals in cytokine-induced G1 to S cell cycle transition. EMBO J. 17: 6670-6677,1998

4. Fukada, T., M. Hibi, Y. Yamanaka, M. Takahashi-Tezuka, Y. Fujitani, T. Yamaguchi, K. Nakajima, and T. Hirano. Two signals are necessary for cell proliferation induced by a cytokine receptor gp130: involvement of STAT3 in anti-apoptosis. Immunity 5: 449-460, 1996.

5. Nakajima, K., Y. Yamanaka, K. Nakae, H. Kojima, N. Kiuchi, M. Ichiba, T. Kitaoka, T. Fukada, M. Hibi and T. Hirano. A central role for Stat3 in IL-6-induced regulation of growth and differentiation in M1 leukemia cells. EMBO J. 15:3651-3658, 1996.

瀧　伸介

1. Feng, C., Watanabe, S., Maruyama, S., Suzuki, G., Sato, M., Furuta, T. Kojima, S., Taki, S. and Asano Y., An alternate pathway for type 1 T cell differentiation. Int. Immunol., 11: 1185-1194, 1999.

2. Ogasawara, K., Hida, S., Azimi, N., Tagaya, Y., Sato, T., Yokochi-Fukuda, T., Waldmann, T.A., Taniguchi, T. and Taki, S., Requirement for IRF-1 in themicroenvironment supporting development of natural killer cells. Nature 391: 700-703, 1998.

3. Taki, S., Sato, T., Ogasawara, K., Fukuda, T., Sato, M., Hida, H., Suzuki, G., Mitsuyama, M., Shin, E.-H., Kojima, K., Taniguchi, T. and Asano, Y., Multi-stage regulation of Th1-type immune responses by the transcription factor IRF-1. Immunity 6: 673-679, 1997.

4. Tamura, T., Ishihara, M., Lamphier, M.S., Tanaka, N., Oishi, I., Aizawa, S., T., Mak, T.W., Taki, S. and Taniguchi, T., An IRF-1 dependent pathway of DNA damage-induced apoptosis in mitogen-activated T lymphocytes. Nature 376: 596-599, 1995.

5. Taki, S., Schwenk, F. and Rajewsky, K., Rearrangement of upstream DH and VH region genes into a rearranged immunoglobulin variable region gene inserted into the immunoglobulin heavy chain locus. Eur. J. Immunol. 25:1888-1896, 1995.

竹田　潔

1. Kawai, T., Adachi, O., Ogawa, T., Takeda, K., and Akira, S. : Unresponsiveness of MyD88-deficient mice to endotoxin. Immunity 11, 115-122 (1999).

2. Takeda, K., Takeuchi, O., Tsujimura, T., Itami, S., Adachi, O., Kawai, T., Sanjo, H., Yoshikawa, K., Terada, N., and Akira, S. : Limb and skin abnormalities in mice lacking IKKa. Science 284, 313-316 (1999).

3. Takeda, K., Clausen, B., Kaisho, T., Tsujimura, T., Terada, N., Forster, I., and Akira, S.: Enhanced Th1 activity and development of chronic enterocolitis in mice devoid of Stat3 in macrophages and neutrophils. Immunity 10, 39-49 (1999).

4. Takeda, K., Tsutsui, H., Yoshimoto, T., Adachi, O., Yoshida, N., Kishimoto, T., Okamura, H., Nakanishi, K., and Akira, S.: Defective NK cell activity and Th1 response in IL-18-deficient mice. Immunity, 8, 383-390 (1998)

5. Takeda, K., Tanaka,T., Shi, W., Matsumoto, M., Minami, M., Kashiwamura, S., Nakanishi, K., Yoshida, N., Kishimoto, T., and Akira, S.: Essential role of STAT6 in IL-4 signalling. Nature 380, 627-630 (1996)

吉村昭彦

1. Marine J-C, McKay C, Wang D, Topham DJ, Parganas E, Nakajima H, Pendeville H, Yasukawa H, Sasaki A, Yoshimura A, and Ihle JN.: SOCS3 Is Essential in the Regulation of Fetal Liver Erythropoiesis Cell 98: 617-627, 1999

2. Marine J-C, Topham DJ, McKay C, Wang D, Parganas E, Stravopodis D, Yoshimura A, and Ihle JN: SOCS1 Deficiency Causes a Lymphocyte-Dependent Perinatal Lethality. Cell 98: 609-616, 1999

3. Matsumoto A, Seki Y, Kubo M, Ohtsuka S, Suzuki A, Hayashi I, Tsuji K, Nakahata T, Okabe M, Yamada S, and Yoshimura A: Suppression of STAT5 Functions in Liver, Mammary Glands, and T Cells in Cytokine-Inducible SH2-Containing Protein 1 Transgenic Mice. Mol. Cell Biol. 19: 6396-6407, 1999

4. Yasukawa H, ,Misawa H, Sakamoto H, Masuhara M, Sasaki A, Wakioka T, Ohtsuka A., Imaizumi T, Matsuda T, Ihle JN, and Yoshimura A; The JAK-Binding Protein JAB Inhibits Janus Tyrosine Kinase Activity Through Binding in the Activation Loop. EMBO J 18: 1309-1320, 1999

5. Endo TA, Masuhara M, Yokouchi M, Suzuki R, Sakamoto H, Mitsui K, Matsumoto A, Tanimura S, Ohtsubo M, Misawa H, Miyazaki T, Leonor N, Taniguchi T, Fujita T, Kanekura Y, Komiya S and Yoshimura A ; A new protein containing an SH2 domain that inhibits JAK kinases. Nature 387, 921-924, 1997

高津聖志

1. Kinashi, T., Asaoka, T., Sagara, H., Setoguchi, R., Hirosawa, K., and Takatsu, K. Regulated adhesion by modulating affinity and subcellular localkization of integrin VLA-5 (a5b1) in mast cells. J. Immunol. 162 (5): 2850-2857, 1999.

2. Ogata, N., T. Kouro, A. Yamada, M. Koike, N. Hanai, T. Ishikawa, and K. Takatsu. JAK2 and JAK1 are constitutively associate with an interleukin-5 (IL-5) receptor a and bc subunit, respectively, and are activated upon IL-5 stimulation. Blood 91:2264-2271, 1998.

3. Yasue, T., H. Nishizumi, S. Aizawa, T. Yamamoto, K. Miyake, C. Mizoguchi, S. Uehara, Y. Kikuchi, and K Takatsu. A critical role of Lyn and Fyn for B cell responses to CD38 ligation and interleukin-5. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 10307-10312, 1997.

4. Yoshida, T., K. Ikuta, H. Sugaya, K. Maki, M. Takagi, H. Kanazawa, S. Sunaga, T. Kinashi, K. Yoshimura, J. Miyazaki, S. Takaki, and K. Takatsu. Defective B-1 cell development and impaired immunity against Angiostrongylus cantonensis in IL-5Ra deficient mice. Immunity 4: 483-494, 1996.

5. Kikuchi, K., T. Yasue, Y. Yamashita, K. Miyake, M. Kimoto, and K. Takatsu. CD38 ligation induces Btk activation and enhanced expression of IL-5 receptor a chain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:10879-10883, 1995.

熊ノ郷　淳

1. Atsushi Kumanogoh, Satoko Marukawa, Takayuki Kumanogoh, Hisao Hirota, Kenji Yoshida, Ihn-sook Lee, Kanji Yoshida, Teruhito Yasui, Tetsuya Taga, and Tadamitsu Kishimoto. Impairment of antigen-specific antibody production in transgenic mice expressing a dominant-negetive form of gp130. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94 (1997) , 2478-2482.

2. Atsushi Kumanogoh, Satoko Marukawa, Takayuki Kumanogoh, Hisao Hirota, Kenji Yoshida, Ihn-sook Lee, Kanji Yoshida, Teruhito Yasui, Tadamitsu Kishimoto, and Tetsuya Taga. Impairment of antigen specific antibody production and acute-phase protein induction in transgenic mice expressing a dominant-negetive form of gp130. Leucocyte Typing VI, Garland publishing, Inc., New York (1997) 888-889.

3. Tetsuya Taga and Atsushi Kumanogoh. CD130 workshop summary report. Leucocyte Typing VI, Garland publishing, Inc., New York (1997) 843-845.

4. Atsushi Kumanogoh, Satoko Marukawa, Takayuki Kumanogoh, Ihn-sook Lee, Kenji Yoshida, Kanji Yoshida, Teruhito Yasui, Tadamitsu Kishimoto, and Tetsuya Taga. Impairment of antibody production in transgenic mice overexpressing a dominant-negetive form of gp130. Tissue Antigens. (1996) 48, 392.

5. Kanji Yoshida,Tetsuya Taga, Mikiyoshi Saito, Atsushi Kumanogoh, Takashi Tanaka, Hiroshi Fujiwara, Moritoshi Hirata, Tamotsu Yamagami, Tatsutoshi Nakahata, Tomoko Hirabayashi, Yoshihiro Yoneda, Kazuhiko Tanaka, Wei-Zhong Wang, Chisato Mori, Kohei Shiota, Nobuyuki Yoshida, and Tadamitsu Kishimoto. Targeted disruption of gp130, a common signal transducer for the IL-6 family of cytokines leads to myocardial and hematological disorders. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1996) 93, 407-411.

宮坂昌之

1. Goda, K., Tanaka, T., Monden, M. & Miyasaka, M.: Characterization of an apparently conseved epitope in E- and P-selectin identified by dual-specific monoclonal antibodies. Eur. J. Immunol. 29:1551-1560, 1999.

2. Ishiwatari-Hayasaka, H., Fujimoto, T., Osawa, T., Hirama, T., Toyama-Sorimachi, N. & Miyasaka, M.: Requirements for signal delivery through CD44: Analysis using CD44-Fas chimeric proteins. J. Immunol. 163:1258-1264, 1999.

3. Kawashima, H., Li, Y.-F., Watanabe, N., Hirose, J., Hirose, M. & Miyasaka, M.: Identifification and characterization of ligands for L-selectin in the kidney. I. Versican, a large chondroitin sulfate proteoglycan, is a ligand for L-selectin. Int. Immunol. 11:393-405, 1999.

4. Toyama-Sorimachi, N., Kitamura, F., Habuchi, H., Tobita, Y., Kimata, K. & Miyasaka, M.: Widespread expression of chondroitin sulfate-type serglycin with CD44 binding ability in hematopoietic cells. J. Biol. Chem. 272:26714-26719, 1997.

5. Toyama-Sorimachi, N., Sorimachi, H., Tobita, Y., Kitamura, F., Yagita, H., Suzuki, K. & Miyasaka, M.: A novel ligand for CD44 is serglycin, a hematopoietic cell lineage-specific proteoglycan. J. Biol. Chem. 270:7437-7444, 1995.

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