平成１２年度研究計画

研究項目Ａ０３：免疫システム構築の情報伝達制御

計画研究キ：リンパ球の初期分化を誘導・制御するシグナル伝達機構

○ 1. 烏山　一：プレＢ細胞レセプターを介するＢ細胞分化誘導シグナル(東京都臨床研・室長・免疫学）

2. 反町典子：NK細胞の分化と標的認識機構(東京都臨床研・研究員・免疫学）

3. 生田宏一：Ｔ細胞レセプターγ鎖遺伝子再構成の制御シグナル(京大院・医・助教授・免疫学）

4. 塚田　聡：チロシンキナーゼBtkを介するシグナル伝達(阪大院・医・助手・免疫学)

目的

計画

業績

インパクトファクター

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研究目的

　本研究は、Ｂ細胞、Ｔ細胞ならびにNK細胞が骨髄あるいは胸腺で分化成熟していくために必要な細胞増殖、細胞分化、抗原レセプター遺伝子再構成の誘導シグナルを解析し、その制御機構を明らかにすることを目的とする。

　リンパ球はその分化過程で抗原レセプター遺伝子の再構成を段階的におこなうことにより、抗原認識レパートリーの多様性を獲得する。その中間過程で発現するプレ抗原レセプターがリンパ球の初期分化に決定的な役割を果たしていることが明らかとなったが、レセプターを介する分化誘導のメカニズムはいまだ不明である。最近、烏山はプロＢ細胞上に発現するIｇα/Iｇβ複合体を特異抗体で架橋することにより小型プレＢ細胞へと分化が誘導されることを発見し、それがプレＢ細胞レセプターからのシグナルを解析するのに適したシステムであることを明らかにした。そこで本研究では、この独自の分化誘導システムを応用して分化誘導シグナルにかかわるリン酸化蛋白質分子群を同定し、分化制御の分子機構を明らかにする（烏山）。

　塚田はＢ細胞に発現する新規チロシンキナーゼBtk遺伝子をクローニングし、それがＢ細胞欠損を特徴とする代表的な先天性免疫不全症であるブルートン型無γグロブリン血症の責任遺伝子であることをつきとめた。さらにBtkのSH3ドメインに結合する新規分子Sabを同定し、SabがBtk活性の抑制分子であることを明らかにした。そこで本研究では、Ｂ細胞の分化・活性化・アポトーシスを誘導するシグナル伝達におけるBtkの役割を解明する。Btkを介するシグナル伝達にSabがどのように関与しているのかをノックアウトマウスを作製して解析する。また、BtkのPHドメインならびにSH2ドメインに会合する分子を同定し、Btkシグナル伝達の調節機構を明らかにする（塚田）。

　リンパ球分化のプロセスにおいて、抗原レセプター遺伝子の再構成は２つの異なる遺伝子座で段階的に進むが、どのようなシグナルによって各遺伝子座における遺伝子再構成のオン、オフが制御されているのかはよくわかっていない。そこで、烏山は上述の新規分化誘導システムを用いて、プレＢ細胞レセプターからどのような経路を経て核まで遺伝子再構成制御シグナルが伝達されるのかを解析する（烏山）。生田は、インターロイキン７（IL-7）レセプターのノックアウトマウスを作製し、このマウスではリンパ球の分化が著しく障害されていることを示した。とくにγδＴ細胞は完全に欠如しており、それはγ鎖遺伝子再構成の障害に起因することを明らかにした。さらに、Jγ遺伝子の上流にStat結合配列が存在し、StatによりTCRγ遺伝子のgermline transcriptが誘導されること、活性型Stat5がV-J組換えを引き起こすことを示した。そこで本研究では、IL-7レセプターからγ鎖遺伝子にいたるシグナル伝達経路におけるStat5の役割を解析することにより、γ鎖遺伝子再構成の制御機構を明らかにする（生田）。

　リンパ球のなかでも、ウイルス感染細胞や腫瘍細胞などを排除する自然免疫を担うナチュラルキラー (NK) 細胞は、獲得免疫を担うＴ細胞やＢ細胞とは極めて異なった標的認識機構をもっていることが明らかとなってきた。しかし、その分化制御機構、レパートリー形成機構、免疫寛容の機構などに関してはほとんどわかっていない。最近、反町はNK細胞の分化初期に選択的に発現する新規レセプター分子をコードする遺伝子の単離ならびにNK細胞特異的モノクローナル抗体の樹立に成功した。そこで、本研究では、新規NKレセプターのリガンド、シグナル伝達ならびに発現調節を解析し、NK細胞分化の制御機構を明らかにする（反町）。

　以上のように、独自の解析システムを用いた我々の研究はこれまでにひきつづき、リンパ球分化の研究領域をリードしていくものと考える。

研究計画

１．プレＢ細胞レセプターを介するＢ細胞分化誘導シグナルの解析（烏山）

（１）新規シグナル伝達分子の同定と遺伝子クローニング

　すでに新規のＢ細胞分化誘導システムを用いて、分子量36kDの蛋白質がプレＢ細胞レセプターからのシグナルにより選択的にチロシンリン酸化されることを見いだしている。そこで、細胞の大量培養、36kDチロシンリン酸化蛋白質の単離精製をおこない、アミノ酸配列の一部を決定する。それに基づき、当該遺伝子をクローニングする。

（２）免疫グロブリン遺伝子再構成の制御シグナルの解析

　新規のＢ細胞分化誘導システムを応用して、プレＢ細胞レセプターからのシグナルによりＨ鎖遺伝子の対立遺伝子排除ならびにＬ鎖遺伝子再構成が誘導されるかどうかを検証するとともに、その制御機構を解析する。

２．チロシンキナーゼBtkを介するシグナル伝達の解析（塚田）

（１）Btk依存的に転写が誘導される遺伝子群の同定

　正常およびBtk欠損B細胞上の抗原レセプターを刺激し、differential displayおよびDNAマイクロアレイ法によって依存的に転写が誘導される遺伝子群を同定し、さらにBtkとBtk依存的転写分子群の中間に存在する分子を同定する。

（２）BtkによるPLCγの活性化機構の解明

　BtkによるPLCγのチロシンリン酸化部位を同定し、アダプター分子BLNKを介したBtkによるPLCγ活性化の活性化メカニズムを明らかにする。

（３）Btk抑制因子Sabノックアウトマウスの作製と解析

Sabノックアウトマウスを作製し、その形質（どのような疾患を発症するか）を解析する。

３．Ｔ細胞レセプターγ鎖遺伝子再構成の制御シグナルの解析（生田）

（１）転写コアクチベーターを介した染色体accessibilityの調節機構の解析

　Stat5がTCRγ鎖遺伝子のgermline転写を誘導する際に、p300/CBPなどの転写コアクチベーターと協調するかどうかをBa/F3細胞を用いたリポーター・アッセイにて解析する。さらに、リクルートされた転写コアクチベーターにより周辺のクロマチンのヒストンがアセチル化されるかどうかを、染色体免疫沈降法にて解析する。また、この際に細胞にRAG遺伝子を導入することによりDNAが切断され、Jγのシグナル断端が増加するかどうかをLM-PCR法にて解析する。

（２）5' Jγ領域のStat結合配列を破壊したマウスの作製

　γ鎖遺伝子再構成における5' Jγ領域のStat結合配列の役割を明らかにするために、結合配列に突然変異を導入したコンストラクトを構築し、ノックアウトマウスの作製をめざす。

４．NK細胞の分化と標的認識機構の解析（反町）

（１）NK細胞分化初期に優先的に発現する新規NKレセプターの解析

　遺伝子の解析から新規レセプターはLy-49ファミリーに属するものと考えられる。そこで、既存のLy-49分子と識別できるような特異的モノクローナル抗体を作製し、その発現様式、発現調節を解析する。また、MHCクラス分子を中心として新規レセプターのリガンドの同定を進め、NK細胞分化との関連を解析する。

（２）NK細胞特異的モノクローナル抗体Yuri3の認識抗原の同定

　新規に樹立したNK細胞特異的Yuri3抗体が認識する蛋白質の単離精製を試みる。同時に発現クローニングによる当該遺伝子の同定も進める。免疫沈降-ウエスタンブロット法により、会合分子とくにシグナル伝達系に関与する分子を解析し、NKレセプターとしての機能を明らかにする。

研究業績

烏山　一

1. Bosma, G. C., Chang, Y., Karasuyama, H. and Bosma, M. J.: Differential effect of an immunoglobulin m transgene on development of pre-B cells in fetal and adult scid mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96: 11952-11957, 1999.

2. Miyazaki, T., Kato, I., Takeshita, S., Karasuyama, H. and Kudo, A.: l5 is required for rearrangement of the Ig k light chain gene in pro-B cell lines. Int. Immunol.. 11: 1195-1202, 1999.

3. Tsuganezawa, K., Kiyokawa, N., Matsuo, Y., Kitamura, F., Toyama-Sorimachi, N., Kuida, K., Fujimoto, J. and Karasuyama, H.: Flow cytometric diagnosis of the cell lineage and developmental stage of acute lymphoblastic leukemia by novel monoclonal antibodies specific to human preB cell receptor. Blood 92: 4317-4324, 1998.

4. Muto, A., Hoshino, H., Madisen, L., Yanai, N., Obinata, M., Karasuyama, H., Hayashi, N., Nakauchi, H., Yamamoto, M, Groudine, M. and Igarashi, K.: Identification of Bach2 as a B cell-specific partner for small Maf proteins that negatively regulates the immunoglobulin heavy chain gene 3ﾕ enhancer. EMBO J. 17: 5734-5743, 1998.

5. Meffre, E., Papavasiliou, F., Cohen, P., de Bouteiller, O., Bell, D., Karasuyama, H., Schiff, C., Banchereau, J., Liu, Y. J. and Nussenzweig, M. C.: Antigen receptor engagement turns off the V(D)J recombination machinery in human tonsil B cells. J. Exp. Med. 188: 765-772, 1998.

6. Koyama, M., Ishihara, K., Karasuyama, H., Cordell, J. L., Iwamoto, A., and Nakamura, T. CD79a/CD79b heterodimers are expressed on pro-B cell surfaces without associated m heavy chain. Int. Immunol. 9: 1767-1772, 1997.

7. Nagata, K., Nakamura, T., Kitamura, F., Kuramochi, S., Taki, S., Campbell, K. S. and Karasuyama, H.: The Iga/Igb heterodimer on m-negative proB cells is competent for transducing signals to induce early B cell differentiation. Immunity 7: 559-570, 1997.

8. Kuramochi, S., Moriguchi, T., Kuida, K., Endo, J., Semba, K., Nishida, E. and Karasuyama, H.: LOK is a novel mouse STE20-like protein kinase that is expressed predominantly in lymphocytes. J. Biol. Chem. 272: 22679-22684, 1997.

9. Karasuyama, H., Rolink, A. and Melchers, F.: Surrogate light chain in B cell development. Adv. Immunol. 63: 1-41, 1996.

10. Winkler, T. H., Rolink, A., Melchers, F. and Karasuyama, H.: Precursor B cells of mouse bone marrow express two different complexes with the surrogate light chain on the surface. Eur. J. Immunol. 25: 446-450. 1995.

塚田聡

1. Maeda, A., Scharenberg, A.W., Tsukada, S., Bolen, J.B., Kinet, J-P. and Kurosaki, T. 1998. Paired Immunoglobulin-like receptor B (PIR-B) inhibits BCR-induced activation of Syk and Btk by SHP-1. Oncogene 8: 2291-2297,1999.

2. Hashimoto, S., Iwamatsu, A., Kurosaki, T., Okawa, K., Yamadori, T., Matsushita, M., Baba, Y., Kishimoto, T., Kurosaki, T., and Tsukada, S. : Identification of the SH2 domain binding protein of Bruton's tyrosine kinase as BLNK-Functional significance of Btk-SH2 domain in B cell antigen receptor-coupled calcium signaling. Blood 94: 2357-2364, 1999.

3. Yamadori, T., Baba, Y., Matsushita, M., Hashimoto, S., Kurosaki, M., Kurosaki, T., Kishimoto, T., and Tsukada, S. : Bruton's tyrosine kinase activity is negatively regulated by Sab, the Btk-SH3 domain-binding protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96: 6341-6346, 1999.

4. Baba, Y., Nonoyama, S., Matsushita M., Yamadori, T., Hashimoto, S., Imai, K., Arai, S., Kunikata, T., Kurimoto M., Kurosaki, T., Ochs, H. D., Yata, J-I., Kishimoto, T., and Tsukada, S. : Involvement of Wiskott-Aldrich Syndrome Protein in B-Cell Cytoplasmic Tyrosine Kinase Pathway. Blood. 93: 2003-2012, 1999.

5. Matsushita, M., Yamadori, T., Kato, S., Takemoto, Y., Inazawa, J., Baba, Y., Hashimoto, S., Sekine, S., Arai, S., Kunikata, T., Kurimoto, M., Kishimoto, T. and Tsukada, S. Identification and characterization of a novel SH3-domain binding protein, Sab, which preferentially associates with Bruton's tyrosine kinase (Btk). Biochem. Biophys. Res. Commun. 245: 337-343,1998.

6. Nonoyama, S., Tsukada, S., Yamadori, T., Miyawaki, T., Jin, Y.Z., Watanabe,C., Morio, T., Yata,J-I., and Ochs, H.D. : Functional analysis of the peripheral B cells in patients with X-linked agammaglobulinemia. J. Immunol. 161: 3925-3929, 1998.

7. Futatani, T., Tsukada, S., Hashimoto, S., Matsushita, M., Yamadori, T., Niida, Y., Kunikata, T., Arai,. S., Kurimoto, M., Imamura, H., Kishimoto, T., and Miyawaki, T. Flowcytometric detection of Bruton's tyrosine kinase deficiency and its carrier in X-linked agammaglobulinemia. Blood 91: 595-602,1998.

8. Hashimoto, S., Tsukada, S., Matsushita, M., Miyawaki, T., Niida, Y., Yachie, A., Kobayashi, S., Iwata, T., Hayakawa, H., Matsuoka, H., Tsuge, I., Yamadori, T., Kunikata, T., Arai, S., Yoshizaki, K., Taniguchi, N., and Kishimoto, T. Identification of Btk gene mutations and characterization of the derived proteins in 35 XLA families - a nationwide study of Btk deficiency in Japan. Blood 88: 561-573,1996.

9. Li, T., Tsukada, S., Satterthwaite, A., Havlik, M.H., Takatsu, K. and Witte, O.N. Oncogenic activation of Bruton's tyrosine kinase by a point mutation in its pleckstrin homology domain. Immunity 2: 451-460, 1995.

10. Matsuda, T., Takahashi, M., Fukada, T., Tsukada, S., Mano, H., Hirai, H., Witte, O.N. and Hirano, T. Association and activation of Btk and Tec tyrosine kinases by gp130, a signal transducer of the IL-6 family of cytokines. Blood 85: 627-633,1995.

生田宏一

1. Nosaka, T., Kawashima, T., Misawa, K., Ikuta, K., Mui, A. L. F. and Kitamura, T. STAT5 as a molecular regulator of proliferation, differentiation, and apoptosis in hematopoietic cells. EMBO J. 18, 4754-4765, 1999.

2. Ye, S.-K., Maki, K., Kitamura, T., Sunaga, S., Akashi, K., Domen, J., Weissman, I. L., Honjo, T., and Ikuta, K. Induction of germline transcription in the TCRg locus by Stat5: implications for accessibility control by the IL-7 receptor. Immunity, 11:213-223, 1999.

3. Watanabe, N., Nisitani, S., Ikuta, K., Suzuki, M., Chiba, T., and Honjo, T. Expression levels of B cell surface immunoglobulin regulate efficiency of allelic exclusion and size of auto-reactive B-1 cell compartment. J. Exp. Med., 190:461-470, 1999.

4. Yoshida, H., Honda, K., Shinkura, R., Adachi, S., Nishikawa, S., Maki, K., Ikuta, K., and Nishikawa, S.-I. IL-7 receptor a+ CD3- cells in the embryonic intestine induces the organizing center of Peyer's patches. Int. Immunol., 11:643-655, 1999.

5. Shinkura, R., Kitada, K., Matsuda, F., Tashiro, K., Ikuta, K., Suzuki, M., Kogishi, K., Serikawa, T., and Honjo, T. Alymphoplasia (aly) is caused by a point mutation in the mouse NF-kB inducing kinase gene. Nature Genetics, 22:74-77, 1999.

6. Uozumi, N., Kume, K., Nagase, T., Nakatani, N., Ishii, S., Tashiro, F., Komagata, Y., Maki, K., Ikuta, K., Ouchi, Y., Miyazaki, J., and Shimizu, T. Role of cytosolic phospholipase A2 in allergic response and parturition. Nature, 390:618-622, 1997.

7. Miyaura C., Onoe, Y., Inada, M., Maki, K., Ikuta, K., Ito, M., and Suda, T. Increased B-lymphopoiesis by Interleukin 7 induces bone loss in mice with intact ovarian function: Similarity to estrogen deficiency. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 94:9360-9365, 1997.

8. Sunaga, S., Maki, K., Komagata, Y., Miyazaki, J., and Ikuta, K. Developmentally ordered V-J recombination in mouse T cell receptor g locus is not perturbed by targeted deletion of the Vg 4 gene. J. Immunol., 158:4223-4228, 1997.

9. Maki, K., Sunaga, S., and Ikuta, K. The V-J recombination of T cell receptor g genes is blocked in interleukin-7 receptor-deficient mice. J. Exp. Med., 184:2423-2427, 1996.

10. Maki, K., Sunaga, S., Komagata, Y., Kodaira, Y., Mabuchi, A., Karasuyama, H., Yokomuro, K., Miyazaki, J., and Ikuta, K. Interleukin 7 receptor-deficient mice lack gd T cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 93:7172-7177, 1996.

反町典子

1. Ishiwatari-Hayasaka, H., Osawa, T., Fujimoto, T., Hirama, T., Toyama-Sorimachi, N. and Miyasaka, M. ; Requirements for signal delivery through CD44. - Analysis using CD44-Fas chimeric proteins. J. Immunol. 136:1258-1264, 1999.

2. Matsuoka, K., Taya, C., Kubo, S., Toyama-Sorimachi, N., Kitamura, F., Ra, C., Yonekawa, H., and Karasuyama, H. ; Establishment of antigen-specific IgE transgenic mice to study pathological and immunobiological roles of IgE in vivo. Int. Immunol. 11:987-994, 1999.

3. Tsuganezawa, K., Kiyokawa, N., Matsuo, Y., Kitamura, F., Toyama-Sorimachi, N., Kuida, K., Fujimoto, J. and Karasuyama, H. ; Flow cytometoric diagnosis of the cell lineage and developmental stage of acute lymphoblastic leukemia by novel monoclonal antibodies specific to human pre-B-cell receptor. Blood, 92:1-9, 1998.

4. Tsuzuki, S., Toyama-Sorimachi, N., Kitamura, F. and Miyasaka, M. ; FK506 (tacrolimus) inhibits extravasation of lymphoid cells by abrogating VLA-4/VCAM-1 mediated transendothelial migration. 　FEBS Letters, 430:414-418, 1998.

5. Tsuzuki, S., Toyama-Sorimachi, N., Kitamura, F., Tsuboi, H., Ando, J., Sakurai, T., Morii, N., Narumiya, S. and Miyasaka, M.; Analysis of intracellular signal-transducing elements involved in transendothelial migration of lymphoma cells. J. J. Cancer Res., 89:571-577, 1998.

6. Toyama-Sorimachi, N., Kitamura, F., Habuchi, H., Tobita, Y., Kimata, K. and Miyasaka, M.; Widespread expression of chondroitin sulfate type serglycins with CD44 binding ability in hemopoietic cells. J. Biol. Chem. 272:26714-26719, 1997.

7. Emoto, K., Toyama-Sorimachi, N., Karasuyama, H., Inoue, K. and Umeda, M.; Exposure of phosphatidylethanolamine on the surface of apoptotic cells. Exp. Cell Res. 232:430-434, 1997.

8. Shimabukuro, K., Toyama-Sorimachi, N., Ozaki, Y., Goi, T., Furukawa, K., Miyasaka, M. and Aso, T.; The expression patterns of standard and variant CD44 molecules in normal uterine cervix and cervical cancer. Gynecologic Oncology 64:26-34, 1997.

9. Toyama-Sorimachi, N. ; CD44 and its ligands. Biotherapy 10:565-573, 1996.

10. Toyama-Sorimachi, N., Sorimachi, H., Tobita, Y., Kitamura, F., Yagita, H., Suzuki, K. and Miyasaka, M.; A novel ligand for CD44 is serglycinn, a hematopoietic cell lineage specific proteoglycan - possible involvement in lymphoid cell adherence and activation. J. Biol. Chem. 270:7437-7444, 1995.

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