平成１２年度研究計画

研究項目Ａ０３：免疫システム構築の情報伝達制御

計画研究ク：リンパ球の系列分岐・運命分岐を決定するシグナル伝達機構

○ 1. 桂　義元：リンパ球系列の決定機構(京大・再生医科学研・教授・免疫学)

2. 高浜洋介：Ｔ細胞選択における運命決定のシグナル(徳島大・教授・免疫学)

目的

計画

業績

インパクトファクター

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研究目的

申請者らは，個々の造血系の前駆細胞の分化能を解析できる方法を開発し，Ｔ細胞系列系を中心に分化プロセスに関して多くの発見を行ってきた．これまでの研究で胸腺へ移行してＴ細胞をつくり出す前駆細胞は，Ｂ系列やミエロイド系列への分化能を失っているという意味でＴ系列にコミットしているものであることを明らかにした．この前駆細胞をp-Tと呼んでいる．実際にはp-Tはナチュラルキラー(NK)細胞や樹状細胞(DC)への分化能を保持しており，さらにab系列とgd系列へ分かれ，正負の選択を受けた後にCD4/CD8Ｔ細胞へと分化する．すなわちp-Tは，なお多様な分化と増殖能を示す前駆細胞であり，p-TからＴ細胞までにはいくつもの系列分岐と共に多数回の細胞分裂(in vitroの実験で105倍，in vivoでは107倍)を伴っている．本研究の目標の中核となるのは，最近われわれが明らかにしたp-TからTCRb鎖の再構成に至るまでに100〜1000倍の増殖が起こることの意味を明らかにすること，さらにこの間に起こるNK系列への分岐との関連である．

　本研究ではＴ細胞系列(NK, DCも含まれる)の中でのさらなる分化プロセスを解明する予定であるが，主要な実験法は，われわれが開発したmultilineage progenitor (MLP)アッセイを基礎としている．MLPアッセイは個々の造血前駆細胞のＴ，Ｂおよびミエロイド系列への分化能をしらべることができる方法として開発したのであるが，本研究ではさらに，T//NK, T/DC, NK/DC系列への分岐をしらべられるよう改良する．

　Ｔ細胞系列も含めて，造血系の分化では強い増殖が伴う．この事実は，実験システムを組むにあたって表裏一体となる次の２点を考慮する必要がある．�@細胞群として実験した場合，完全に純化されていない限りそこに含まれる細胞の分化能を明らかにすることはできない．�A一方で，実験系さえととのえれば個々の前駆細胞の分化能を明確に知ることができるという利点がある．これらのことは，Ｔ，Ｂ細胞系列を含むMLPアッセイの開発に至るまで理解されることがなかった．MLP法を発表した後もなお，国内外を問わず十分な理解が得られていないようで，極力普及につとめている．

　共同研究者の高浜は，Ｔ細胞分化の最終段階に近い部分で起こる正負の選択について，そに機構を分子レベルで解明することを目標としている．Ｔ細胞は、胸腺での分化過程で有用な抗原特異性を持つクローンのみが選別され，自己と反応する有害なクローンや無用なクローンは排除される．このクローン選択は抗原レセプターを介した一連の反応であるが，抗原レセプターによる認識特異性に応じてどのように細胞生死の運命分岐がもたらされるのか未だ不明である．クローン選択機構の破綻は自己免疫疾患に結びつくと考えられ，その制御機構の解明は臨床的にも極めて重要である．申請者は最近，レトロウイルスを用いた幼若Ｔ細胞への遺伝子導入法とクラゲ発光タンパクを用いた遺伝子導入Ｔ細胞の分化トレース法を確立した．このシステムを用いて，Ｔ細胞のクローン選択における生死の運命付けを決定するシグナルが，ERKキナーゼ経路とp38キナーゼ経路という異なるMAPキナーゼ経路を介して伝達されることを明らかにした．そこで，本研究ではこの新規システムを応用して，胸腺におけるＴ細胞の正ならびに負の選択におけるMAPキナーゼカスケード上流分子群（Raf-1, ASK1, TAK1などのMAPKKKシグナル伝達分子）の動態と関与を明らかにし，クローン選択における細胞生死を決定づける分子シグナルのより詳しい理解を目指す．

研究計画

1. 胸腺前駆細胞(p-T)からNK, DCとの分岐点およびabＴ細胞系列とgdＴ細胞系列へ の分岐点を明らかにする研究

　MLPアッセイ法をＴ細胞とNK細胞の分化に適した培養法へと改良し，この培養系へ個々のp-Tを加えて培養する．p-Tは胸腺中のいろいろの分化段階のものを用い，つくられたＴおよびNK細胞のTCRbおよびTCRg鎖の再構成をPCRでしらべる．この分化には強い増殖が伴うが，SCFやIL-7などの増殖因子の作用を検討し，分化がどのように増殖とかかわっているのかを明らかにする．

　p-Tから出現するDC細胞数が極端に少ないので，DCへの分化はＴ細胞やNK細胞への分化と同列には解析できない．この場合は，ストローマ細胞上でのpair daughterアッセイを併用する．２つに分かれた細胞ペアのそれぞれを，DC誘導の培養系またはＴおよびNK誘導用の培養系へ移して解析する．

2. T/NK系列にかかわる遺伝子の役割りに関する研究

　レトロウイルスベクターを利用した遺伝子導入によって，特定の分子のT/NK系列への分岐の機構を解する．実験には主に転写因子の遺伝子を用いる．正常な遺伝子またはdominant negative型遺伝子を緑色マーカーとなるGFP遺伝子と共にレトロウイルスベクターを用いて導入し，GEP陽性細胞をMLPアッセイまたはその変法によって解析する．本年度はId2遺伝子を用いるが，GATA-3, Tcf-1, Lef-1なども用いる準備を行う．

2. 高浜は，同様の遺伝子導入法を利用してＴ細胞のクローン選択における細胞生死の分岐決定シグナルを解析する．すでに正の選択による細胞分化誘導にはMKK1→ERKキナーゼ経路、負の選択による細胞死誘導にはMKK6→p38キナーゼ経路と，異なるMAPキナーゼ経路の活性化がそれぞれ優先的に関与することを明らかにし，一方、正と負のクローン選択はいずれも抗原レセプターに会合するチロシンキナーゼZAP-70を介して惹き起こされるので，本研究においては，正と負の選択を起こすZAP-70信号がどのようにMKK1とMKK6の優先的活性化をもたらすのか解析する．具体的には，MKK1を直接活性化するMAPKKKであるRaf-1あるいはMKK6を直接活性化するASK1やTAK1などのMAPKKKが，Ｔ細胞のクローン選択を惹き起こす抗原レセプター信号によって活性化されるのか否かを検討する．これらの分子群のなかでクローン選択誘導信号に関与するキナーゼを特定した上で、各分子の不活性化変異体を幼若Ｔ細胞へと導入することによって、ERKキナーゼとp38キナーゼの選択的活性化を規定あるいは分岐するMAPKKKを同定する．これらの解析を進めることによって，MAPキナーゼ経路上流キナーゼMAPKKK分子群のクローン選択における分別関与の動態を明らかにする．

研究業績

　桂　義元

1. Ikawa, T., Kawamoto, H., Fujimoto, S. & Y.Katsura. Commitment of common T/NK progenitors to unipotent T and NK progenitors in the murine fetal thymus revealed `by a single progenitors assay. J. Exp. Med. 190:1617-1625, 1999

2. Ohmura, K., Kawamoto, H., Fujimoto, S., Ozaki, S., Nakao, K. & Katsura, Y. Emergence of T, B and myeloid lineage commitment as well as multipotent hematopoietic progenitors in the AGM region of day 10 fetuses of the mouse. J. Immunol. 163:4788-4795, 1999

3. Kawabata, K., Ujikawa, M., Egawa, T. , Kawamoto, H., Tachibana, K. , Iizawa, H. , Katsura, Y. , Kishimoto, T. & Nagasawa, T. A cell-autonomous requirement for CXCR4 in long-term lymphoid and myeloid reconstitution. Proc.Natl.Acad.Sci. USA 96:5663-5667, 1999

4. Kawamoto, H., Ohmura, K., Fujimoto, S. & Katsura, Y. Emergence of Tcell lineage restricted progenitors at the earliest stage of hematopoiesis in the murine fetal liver. J. Immunol. 162:2725-2731, 1999

5. van Ewijk, W. , Wamg, B.-P. , Hollander, G., Kawamoto, H., Spanopoulou, E., Itio, M., Amagai, T., Jiang, Y-F., Germeraad, W., Chen, W-F. & Katsura, Y. Thymic microenvironments, 3-D versus 2-D? Seminars in Immunology, 11:57-64,1999

6. Kawamoto, H., Ohmura, K. & Katsura, Y. Presence of progenitors restricted to T, B or myeloid lineage but absence of multipotent stem cells in the murine fetal thymus. J. Immunol. 161:3799-3802, 1998

7. Nishikawa, S-I., Nishikawa, S., Kawamoto, H., Yoshida, H., Kizumoto, M., Kataoka, H. ,& Katsura, Y. In vitro generation of lymphohematopoietic cells from endothelial cells purified from murine embryos. Immunity 8: 761-769, 1998

8. Okamoto, Y., Eda. Y., Ogura, A., Shibata, S., Amagai, T., Katsura, Y., Asano, T., Kimachi, K., Makizumi, K. & Honda, M.. In SCID-hu mice passive transfer of a hummanized antibody prevents infection and atrophic change of medulla in human thymic implant duu to intravenous inoculation of primary HIV-1 isolate. J Immunol.160:69-76. 1998

9. Kawamoto, H., Ohmura, K. & Katsura, Y. Direct evidence for the commitment of hematopoietic stem cells to T, B and myeloid lineages in murine fetal liver. Int. Immunol. 9:1011-1019, 1997

10. Watanabe, Y., Aiba, Y. & Katsura, Y. T cell progenitors in the murine fetal liver: Differences from those in the adult bone marrow. Cell. Immunol. 177: 18-25, 1997

11. Kawamoto, H., Ohmura, K., Hattori, N. & Katsura, Y. Hematopoietic progentiorsin the murine fetal liver capable of rapidly generating T cells. J. Immunol. 158:3118-3124, 1997

12. Sawamura, T. , Kume, N. , Aoyama, T. , Moriwaki, H. , Hoshikawa, H. , Aiba, Y. , Tanaka, T., Miwa, S. , Katsura, Y., Kita, T. & Masaki, T. Anendothelial receptor oxidized low-density lipoprotein. Nature 386:73-77, 1997

13. Hattori, N., Kawamoto, H. & Katsura, Y. Isolation of the most immature populationof murine fetal thymocytes that includes progenitors capable of generating T, B andmyeloid cells. J. Exp. Med. 184:1901-1908, 1996

14. Hattori, N., Kawamoto, H., Fujimoto, S., Kuno, K. & Katsura, Y. Involvement of transcription factors TCF-1 and GATA-3 in the initiation of the earliest step of T celldevelopment in the thymus. J. Exp. Med. 184:1137-1147, 1996.

15. Wada, K., Kina, T., Kawamoto, H., Kondo, M. & Katsura, Y. Requirement of cell interactions through adhesion molecules in the early phase of T cell development.Cell. Immunol. 170:11-19, 1996

16. Mazda, O., Aiba, Y., Hattori, N., Li, M., Fujimoto, S., Davis, M. M. & Katsura, Y. Abrogation of the allelic exclusion in a T cell receptor b chain gene transgenic mouse strain. Immunological Investigations 24:927-946, 1995

17. Honda, M., Matsuo, K., Nakasone, T. , Okamoto, Y., Yoshizaki, H., Kitamura, K. Sugitani, W., Watanabe, K., Fukushima, Y., Haga, S., Katsura, Y., Tasaka, H., Komuro, K., Yamada, T., Asano, T., Yamazaki, A., Yamazaki, S. Protectiveimmune responses induced by secretion of a chimeric soluble protein from a recombi-nant Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin vector candidate vaccine for human immunodeficiency virus type 1 in small animals. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:10693-10697, 1995

18. Hosono, M. , Toichi, E. , Hosokawa, M. , Imamura, S. , Gyotoku, J. , Katsura, Y. Hosokawa, M.. Development of autoreactivity and changes of T cell repertoire in different strains of aging mice. Mech Ageing Dev. 78:197-214, 1995

19. Dou, Y-M., Watanabe, Y., Aiba, Y., Wada, K. & Katsura, Y. A novel culturesystem for induction of T cell development: Modification of fetal thymus organ culture. Thymus 23:195-207, 1995

高浜洋介

1. Kaneta, M., Osawa, M., Osawa, M., Sudo, K., Nakauchi, H., Farr, A. & Takahama, Y. A role for Pref-1 and HES-1 in thymocyte development. J. Immunol. in press.

2. Spain, L. M., Law, L. L. & Takahama, Y. Retroviral infection of T cell precursors in thymic organ culture. In: Developmental Biology Protocols. eds. Tuan, R. & Lo, C.; Humana Press, NJ, USA; in press.

3. Takahama, Y. Differentiation of mouse thymocytes in fetal thymus organ cultureIn: T Cell Protocols: Development and Activation. ed. Kearse, K. P. Humana Press, NJ, USA; in press .

4. Apostolou, I., Takahama, Y., Belmant, C., Kawano, T., Huerre, M., Marchal, G., Cui, J., Taniguchi, M., Nakauchi, H., Fournie, J. J., Kourilsky, P. & Gachelin, G. Murine natural killer T cells contribute to the granulomatous reaction caused by myco- bacterial cell walls. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:5141-5146, 1999.

5. Sugawara, T., Moriguchi, T., Nishida, E., & Takahama, Y. Differential roles ofERK and p38 MAP kinase pathways in positive and negative selection of Tlymphocytes. Immunity 9:565-574, 1998.

6. Tokoro, Y., Sugawara, T. Yaginuma, H., Nakauchi, H., Terhorst, C., Wang, B. & Takahama, Y. A mouse carrying genetic defect in the choice between T and B lymphocytes. J. Immunol. 161:4591-4598, 1998.

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8. Takahama, Y., Ohishi, K., Tokoro, Y., Sugawara, T., Yoshimura, Y., Okabe, M., Kinoshita, T. & Takeda, J. Functional competence of T cells in the absence of glycosylphosphatidylinositol-anchored proteins caused by T cell-specific desruptionof the Pig-a gene. Eur. J. Immunol. 28: 2159-2166, 1998.

9. Takahama, Y., Tokoro, Y., Sugawara, T., Negishi, I. & Nakauchi, H. Pertussis toxin can replace TCR signals that induce positive selection of CD8 T cells. Eur. J. Immunol. 27:3318-3331, 1997.

10. Sagara, S., Sugaya, K., Tokoro, Y., Tanaka, S., Takano, H., Kodama, H., Nakauchi, H. & Takahama, Y. B220 expression by T lymphoid progenitor cells in mouse fetal liver. J. Immunol. 158:666-676, 1997.

11. Masuda, K., Makino, Y., Cui, J., Ito, T., Tokuhisa, T., Takahama, Y., Koseki, H.,Tsuchida, K., Koike, T., Moriya, H. Amano, M. & Taniguchi, M. Phenotypes and invariant ab TCR expression of peripheral Va14+ NK T cells. J. Immunol. 158: 2076-2082, 1997.

12. Takahama, Y. & Nakauchi, H. Phorbol ester and calcium ionophore can replace TCR signals that induce positive selection of CD4 T cells. J. Immunol. 157:1508-1513, 1996.

13. Tokoro, Y., Tsuda, S., Tanaka, S., Nakauchi, H. & Takahama, Y. CD3-induced apoptosis of CD4+CD8+ thymocytes in the absence of clonotypic T-cell antigen receptor. Eur. J. Immunol. 26:1012-1017, 1996.

14. Tsuda, S., Rieke, S., Hashimoto, Y., Nakauchi, H. & Takahama, Y. IL7 supports D-J but not V-DJ rearrangement of T cell receptor b gene in fetal liver progenitor cells. J. Immunol. 156:3233-3242, 1996.

15. Takahama, Y., Sugaya, K., Tsuda, S., Hasegawa, T. & Hashimoto, Y. Regulation of early T cell development by the engagement of TCRb complex expressed on fetalthymocytes from TCRb-transgenic scid mice. J. Immunol. 154:5862-5869, 1995.

16. Satake, M., Nomura, S., Iwai-Yamaguchi, Y., Takahama, Y., Hashimoto, Y., Niki, M., Kitamura, Y. & Ito, Y. Expression of the Runt domain coding PEBP2a gene during thymic development. Mol. Cell. Biol. 15:1662-1670, 1995.

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