平成１２年度研究計画

研究項目Ａ０２：抗原認識のシグナル変換機構

計画研究オ：B細胞の抗原認識と活性化制御

○ 1. 黒崎知博：B細胞の抗原受容体シグナルによる活性化制御(関西医大・肝臓研・教授・分子生物学)

2. 阪口薫雄：Ｂ細胞特異的シグナル伝達機構

目的

計画

業績

インパクトファクター

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研究目的

　B細胞抗原受容体 (BCR)を介した刺激によってB細胞は、3種類の細胞内チロシンキナーゼ(PTK), Lyn, Syk, Btkが活性化され、これら細胞膜直下・細胞質で生じる一連の反応が核内に伝達され、細胞増殖の制御及び異なる遺伝子発現の誘導を行うわけであるが、これらLyn, Syk, Btkからシグナルが分岐・統合していくメカニズムこそは、B細胞において単一レセプターから多様な細胞運命（増殖、細胞死、分化、記憶）が決定される機構である。そこで、このシグナルの分岐・統合の分子機構を、細胞膜直下及び細胞質で生じる反応については黒崎が、核内で生じる反応については阪口が担当して解明していく。

　黒崎は過去３年間Sykによりチロシン燐酸化されるターゲット蛋白質の単離・機能解析の研究を行ってきており、その結果、B細胞特異的新規シグナル分子BLNKがPLC-g2, JNK活性化に必須の役割を担っていることを明らかにしてきた。阪口は胚中心B細胞で特異的にその発現が上昇するシグナル分子GANPを単離した。GANPは210KDaの核内分子で細胞複製機能分子MCM3と結合しているという重要な知見を既に得ている。本研究課題では、これら申請者らの今までの実績に基づき、細胞内シグナル分子BLNK、核内シグナル分子GANPのB細胞シグナル伝達に於ける機能解明・上流下流へのカップリング分子機序を明らかにしていく。

本研究の独創的な点は、黒崎、阪口の研究グループで世界に先駆けて単離されたシグナル分子、BLNK, GANPの欠損マウス・B細胞を樹立し、分子遺伝学的・生化学的・形態学的手法を駆使して、これらのシグナル分子の上流、下流のカップリングメカニズム、及び免疫応答における役割を解明する点にあり、十分な国際競争力を有するものである。

研究計画

1) BLNKのチロシン燐酸化サイトの決定及び機能検定（黒崎担当）

　　　BLNKに複数存在するチロシン残基のどの残基が刺激依存性に燐酸化されるかを明らかにする。更に決定されたBLNKチロシン燐酸化サイトの重要性を検定するために変異BLNKを作製し、BLNK欠損DT40 B細胞に導入し機能検定を行う。

2) BLNKのSH2, proline-richドメインの機能検定、及び結合蛋白質の同定（黒崎担当）

　　　BLNKのproline-rich, SH2 domainの変異体を作製し、BLNK欠損DT40 B細胞に導入することにより、BLNKの機能発現がどのように変異するかを調べる。又、これらドメインに特異的に結合する蛋白質の単離・同定を行う。

3) GANPが細胞複製分子MCM3とクロマチン上で結合しているかどうかの検定（阪口担当）

　　　GANPがMCM3と特異的に結合することをB細胞株を用い明らかにする。pull downアッセイを用いGANPのどのドメインが結合に必須なのか、そしてその結合が核内、クロマチン上で起こるのかを免疫沈降、蛍光染色法で示す。

4) GANP遺伝子欠損マウスを用いた胚中心B細胞の分化、成熟におけるGANP分子の機能解析（阪口担当）

　　　T細胞依存性抗原刺激におけるB細胞の分化・成熟を解析するために、GANP遺伝子欠損マウスを作製する。現在F1の解析中である。このマウスを用いて、特にB細胞分化、免疫応答の機能変化について解析を行う。

研究業績

黒崎　知博

1. Hashimoto, S., Iwamatsu, A., Ishiai, M., Okawa, K., Yamadori, T., Matsushita, M., Baba, Y., Kishimoto, T., Kurosaki, T. and Tsukada, S. Identification of the SH2 domain binding protein of Bruton's tyrosine kinase as BLNK: Functional significance of Btk-SH2 domain in B cell antigen receptor-coupled calcium signaling. (1999) Blood 94, 2357-2364

2. Ishiai, M., Kurosaki, M., Pappu, R., Okawa, K., Ronko, I., Fu, C., Shibata, M., Iwamatsu, A., Chan, A.C. and Kurosaki, T. BLNK required for coupling Syk to PLC-g2 and Rac1-JNK in B cells. (1999) Immunity 10, 117-125

3. Kurosaki, T. Genetic analysis of B cell antigen receptor signaling. (1999) Annu. Rev. Immunol. 17, 555-592

4. Hashimoto, A., Okada, H., Jiang, A., Kurosaki, M., Greenberg, S., Clark, E.A. and Kurosaki, T. Involvement of guanosine trisphosphatases and phospholipase C-g2 in extracellular signal-regulated kinase, c-Jun NH2-terminal kinase, and p38 mitogen-activated protein kinase activation by the B cell antigen receptor. (1998) J. Exp. Med. 188, 1287-1295

5. Maeda, A., Kurosaki, M. and Kurosaki, T. Paired Immunoglobulin-like Receptor (PIR)-A is involved in activating mast cells through its association with Fc receptor g chain. (1998) J. Exp. Med. 188, 991-995

6. Fu, C., Turck, C., Kurosaki, T. and Chan, A.C. BLNK: A central linker protein in B cell activation. (1998) Immunity 9, 93-103

7. Ono, M., Okada, H., Bolland, S., Yanagi, S., Kurosaki, T. and Ravetch, J.V. Deletion of SHIP or SHP-1 reveals two distinct pathaway for inhibitory signaling. (1997) Cell 90, 293-301

阪口　薫雄

1. Hayashi, K., Igarashi, H., Ogawa, M., and Sakaguchi, N. Activity and substrate specificity of the mouse STK2 serine threonine kinase that is structurally related to the regulator protein NIMA of Aspergillus nidulans. (1999) Biochem. Biophys. Res. Commu. (in press).

2. Maeda, K., Inui, S., Tanaka, H., and Sakaguchi, N. A new member of the a4-related molecule (a4-b) that binds to the protein phosphatase 2A is expressed selectively in the brain and testis. (1999) Eur. J. Biochem. 263, 1-6

3. Inui, S., Sanjo, H., Maeda, K. and Sakaguchi, N. A lymphocyte signal transduction molecule alpha4 associates with the catalytic subunit of phosphatase 2A and acts as a new target of rapamycin. (1998) Blood 92, 539-546

4. Igarashi, H., and Sakaguchi, N. Telomerase activity is induced in human peripheral B lymphocytes by the stimulation to antigen receptor. (1997) Blood 89, 1299-1307

5. Yamashita, Y., Miyake, K., Miura, Y., Kaneko, Y., Yagita, H., Suda, T., Nagata, S., Nomura, J., Sakaguchi, N., and Kimoto, M. Activation mediated by RP105 but not CD40 makes normal B cells suscetible to anti-IgM-induced apoptosis: a role for Fc receptor co-ligation. (1996) J. Exp. Med. 184, 113-120

6. Inui, S., Kuwahara, K., Mizutani, J., Maeda, K., Kawai, T., Nakayasu, H. and Sakaguchi, N. Molecular cloning of a cDNA clone encoding a phosphoprotein component related to the immunoglobulin receptor (IgR)-mediated signal transduction. (1995) J. Immunol. 154, 2714-2723

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