平成１２年度研究計画

研究項目Ａ０２：抗原認識のシグナル変換機構

計画研究エ： T細胞の抗原認識と活性化制御

○ 1. 齊藤　隆：TCRシグナルの正・負の制御機構(千葉大院・医・教授・免疫学)

2. 中山俊憲：Ｔ細胞の機能分化を制御するシグナル伝達機構(千葉大院・医・助教授・免疫学)

3. 湊　長博：Ｇ蛋白によるＴ細胞機能制御(京大院・医・教授・免疫学)

4. 西村泰治：Ｔ細胞の抗原認識と活性化機構の多様性

目的

計画

業績

インパクトファクター

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研究目的

�@何をどこまで明らかにするのか。

抗原特異的な免疫応答は、抗原提示細胞によって外来抗原が8-20個のペプチドに限定的分解を受け、自己のMHCと会合して細胞表面に発現し、それをT細胞がTCRによって認識し活性化されることによって開始する。TCRを介する抗原認識シグナルは異なる機能発現を誘導し、細胞の異なる運命を制御する。本研究では、TCRによる抗原認識シグナルの解明とその量と質によって細胞の機能と運命が決定される分子機構の解析を目指す。

(1) TCR-MHC-ペプチドの三者のアフィニティーと細胞間相互作用とによる総合的なTCRシグナルの強さが活性化とその後の細胞の運命を決定する。一部のアミノ酸を置換させたペプチド（APL）によって、T細胞の機能を修飾させることができことから、多様なMHCに対して、種々に変化をさせたペプチドによるT 細胞に機能変化をもたらすシグナル伝達系を多面的に解析し、免疫応答を人為的に制御できるシステムを確立する。

(2) TCRによる抗原認識によりCD3分子のITAMのリン酸化、SrcおよびSykファミリーキナーゼの活性化が起こり、種々の基質および複数のシグナルカスケードの活性化を経て異なる機能を誘導する。TCR複合体の発現制御を解明するとともに、この制御系においてシグナル分岐に関与する種々のアダプター分子、およびシグナル伝達における分子スイッチとしてのRas, Rho, Rac, Cdc42,Rapなどの低分子G蛋白系、の解析を通してT細胞活性化の正負の制御系を明らかにする。また、こうした活性化シグナルの質的な修飾は、補助シグナルとの相互作用によって調節されている。とりわけ、TCR活性化を正に補助するCD28シグナルとCTLA-4による抑制シグナルの関係も明らかでなく、CTLA-4を介する抑制シグナルのシグナル伝達機構を明らかにし、TCR-補助シグナルの相互関係を解明する。

(3) 更に、TCRシグナルの量と質の調節によるＴ細胞の機能的分化の制御系を解析する。感染・アレルギーや自己免疫にたいする免疫応答においてTh1/Th2のバランスが重要である。ナイーブT細胞が末梢でTh1/Th2を誘導する制御系を、TCRとサイトカインのシグナル伝達系の関係の解析を通して明らかにする。

�A学術的な特色・創造的な点、予想される結果と意義

本研究によって、これまで解析されてきた種々のTCRシグナル伝達系の個々の関連のみでなく、正負のダイナミックな制御機構が明らかになる。これを誘導する抗原ペプチドの構造との関係も解明される。種々の機能分岐を司るアダプター分子やG蛋白のT細胞における役割が解明される。TCRシグナルとco-stimulationシグナル、サイトカインシグナルの相互作用を明らかにし、それによってT細胞機能分化の調節が可能となる。これらを通して、免疫細胞・反応の人為的制御への基礎を築く。

�B国内外の関連する研究の中での当該研究の位置付け

TCRを介する認識シグナルの解析は、T細胞の活性化制御が免疫応答制御の中心だけに、世界的に精力的に進められている。抗原ペプチドの認識では、APLによってT細胞にCD3zやZAP70の活性化、Ca2+反応などが異なることが判明しているが、機能的な相違との関係は未だ不明である。ヒトT細胞の解析では本研究が最先端である。その下流のアダプター分子を中心とするシグナル複合体の解析では、SLP-76,LATなどのScaffold蛋白が米国グループによって解析されてきたが、TCR複合体と会合して制御しているGab1/2は本邦で同定され、活性化制御の中心を担う分子である可能性を持っている。また、T細胞ではその役割がまだ明らかでないG蛋白についても、本邦で取られてRap-1GAPの解析が制御系の中心になると考えられる。TCRシグナルの量と質によるT細胞の機能分化においては、CN, Lck, MAPKなどの微妙なシグナル量が分化を制御する結果は、本研究の重要な方向になっている。米国を中心にサイトカイン遺伝子のリモデリングの解析が始まっており、シグナル量・質とリモデリングの関係を解析できる状況にある。T細胞活性化シグナルの重要な制御系としてのCTLA-4による調節は、臨床応用も含めて注目されているが、世界的に解析が進まない中で、本研究のシグナル解析が最も進んでおり、今後はRap-1との関連などからも、本研究班全体の連携のなかで解明されると期待される。

研究計画

斉藤

1) TCR複合体発現および機能変異株を作成し、cDNAライブラリーのレトロウイルス感染系を用いる発現クローニングにより、TCR発現、活性化シグナルに重要な分子を同定する。

2) TCRシグナルにおけるアダプター分子Gab2の役割を、会合する分子の解析、SHP-2結合部位変異分子の解析によって明らかにする。

3) CTLA-4の発現調節と抑制シグナル伝達の機構を、変異CTLA-4を発現させたT細胞クローンを用いて解析し、構造ﾑ機能の相関関係を明らかにする。

中山

1) TCRの下流のシグナル伝達系によるIL-4Rの下流のシグナル伝達系の調節（クロストーク）について解析を行う。IL-4を作用させた時のIL-4レセプターの構造の変化、リン酸化の状態の変化、STAT6を活性化するJAKキナーゼの活性化状態、などを指標に、Ras/MAPKカスケードやCa/カルシニューリン系のターゲット分子を同定する。

2) IL-4やIFN-gの遺伝子におけるDNAのメチル化を指標にして、IL-4, IFN-gの産生調節とTh1/Th2細胞の分化制御機構を解析する。また、STAT6のIL-4遺伝子への結合時におけるヒストンアセチルトランスフェラーゼP300/CBPの関与をTh1やTh2細胞で検討する。

湊

1) 免疫沈降法、Two hybrid法などにより、T細胞におけるRap１GTPおよびSPA-1の特異的会合分子を同定、単離する。

2) レトロウイルスによる遺伝子導入によりこれらを介するエフェクター機構と機能を明らかにする。

3) Rap１のdominant positive/negativeな変異体を用い、Ras, RhoAを介するシグナル伝達系にたいするRap1系の効果を解析する。

西村

1) あらゆるHLAクラスII 分子のペプチド収容溝に結合する性質をもつインバリアント(Ii) 鎖のCLIP部分を膨大な種類のペプチドに置換した変異 Ii 鎖をコードする組み換えIi 鎖遺伝子を作製し、拘束HLAクラスII 遺伝子と共にCos細胞に導入して、多様なHLAクラスII・ペプチド複合体を一過性に発現する細胞ライブラリーを樹立する。

2) 作成したライブラリーとT細胞クローンとを共培養し各種のサイトカイン産生を指標にして、TCRリガンドを同定し、その多様性と多彩なT細胞応答との関係について解析する。

研究業績

斉　藤　隆

1. Nakaseko, C., Miyatake, S., Iida, T., Abe, R. and Saito, T. : CTLA-4 engagement delivers inhibitory signal upon T cell activation in the absence of its tyrosine motif in the cytoplasmic tail. J. Exp. Med. 190:765-774, 1999.

2. Arase, K., Saijo, K., Watanabe, H., Konno, A., Arase, H., and Saito, T.: Ablation of a specific cell population by the replacement of a uniquely expressed gene with a toxin gene. Proc. Natl. Acad. Sci. 96:9264-9268, 1999.

3. Yamazaki, T., Hamano, Y., Tashiro, H., Ito, K., Nakano, H., Miyatake, S. and Saito, T.: CAST, a novel CD3e-binding protein transducing activation signal for IL-2 production in T cells. J. Biol. Chem. 274:18173-18180, 1999.

4. Park, S.Y., Ueda, S., Ohno, H., Hamano, Y., Tanaka, M., Shiratori, T., Yamazaki, T., Arase, H., Arase, N., Karasawa, A., Satoh, S-I., Ledermann, B., Kondo, Y., Okumura, K., Ra, C. and Saito, T. : Resistance of Fc receptor-deficient mice to fatal glomerulonephritis. J. Clin. Inv. 102:1229-1238, 1998.

5. Arase, N., Arase, H., Park, S.Y., Ohno, H., Ra, C. and Saito, T. Association with FcRg is essential for activation signal through NKR-P1(CD161) NK cells and NK1.1+ T cells. J. Exp. Med. 186:1957-1963, 1997.

6. Shiratori,, T., Miyatake, S., Ohno, H., Nakaseko, C., Isono K., Bonifacino, J.S. and Saito, T. Tyrosine phosphorylation controls internalization of CTLA4 by regulating its int eraction with clathrin-associated adaptor complex AP-2. Immunity 6:583-589, 1997.

7. Saijo, K., Park, S.Y., Ishida, Y., Arase, H. and Saito, T. Crucial role of Jak3 in negative selection of self-reactive T cells. J. Exp. Med. 185:351-356, 1997.

8. Otsuji, M., Kimura, Y., Aoe, T., Okamoto, Y. and Saito, T. Oxidative stress by tumor-derived macrophages suppresses the expression of CD3z chain of T cell receptor complex and antigen-specific T cell responses. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93:13119-13124, 1996.

9. Park, S. Y., Saijo, K., Takahashi, T., Osawa, M., Arase, H., Hirayama, N., Miyake, K., Nakauchi, H., Shirasawa, T. and Saito, T. Developmental defects of lymphoid cells in Jak3 kinase-deficient mice. Immunity 3:771-782, 1995.

10. Ono, S., Ohno, H. and Saito, T. Rapid turnover of the CD3_ chain independent of the TCR-CD3 complex in normal T cells. Immunity 2:639-644, 1995.

中山　俊憲

1. Cui, J., Watanabe, N., Kawano, T., Yamashita, M., Kamata, T., Shimizu, C., Koike, J., Koseki, H., Tanaka, Y., Taniguchi, M., and Nakayama, T. Inhibition of Th2 cell differentiation and IgE response by ligand-activated Va14 NKT cells. J. Exp. Med. 190:783-792, 1999.

2. Yamashita, M., Kimura, M., Kubo, M., Shimizu, C., Tada, T., Perlmutter, R. M., and Nakayama T. TCR-mediated activation of Ras/MAPK pathway controlsIL-4 receptor function and Th2 cell differentiation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96:1024-1029, 1999.

3. Kubo, M, Ransom, J., Webb, D., Hashimoto, Y., Tada, T., and Nakayama T. T cell subset-specific expression of the IL-4 gene is regulated by a silencer element and STAT6. EMBO J 16:4007-4020, 1997.

4. Hashimoto, K., Sohn, S. J., Levin, S. D., Tada, T., Perlmutter, R. M., and Nakayama, T. Requirement for p56lck tyrosine kinase activation in TCR-mediated thymic selection. J. Exp. Med. 184:931-943. 1996.

5. Kishimoto H., Kubo R.T., Yorifuji, H., Nakayama, T., Asano, Y., and Tada, T. Physical dissociation of the TCR/CD3 complex accompanies receptor ligation J. Exp. Med. 182:1997-2006. 1995.

湊　長博

1. Nishimura, H., Nose, M., Hiai, H., Minato, N., and Honjo, T. Development of lupus-like autoimmune diseases by disruption of the PD-1 gene encoding an ITIM motif-containing immunoreceptor: Implication for breakedown of peripheral tolerance. Immunity 11: 141-152, 1999.

2. Tomita, K., Hattori, M., Nakamura, E., Nakanishi, S., Minato, N., and Kageyama, R. The bHLH gene Hes1 is essential for proliferation of early T cell precursors. Genes Dev. 13:1203-1210, 1999.

3. Tsukamoto, N., Hattori, M., Yang, H., Bos, J. L., and Minato, N. SPA-1 Negatively Regulates Cell Adhesion through GAP Activity for Rap1. J. Biol. Chem. 274:18463-18469, 1999.

4. Kurachi, H., Wada, Y., Tsukamoto, N, Maeda, M., Kubota, H., Hattori, M, Iwai, K., and Minato, N. Human SPA-1 Gene Product Selectively Expressed in Lymphoid Tissues is a Specific GTPase-activating Protein for Rap1 and Rap2. Segregate expression profiles from a rap1GAP gene product. J. Biol. Chem. 272:28081-28088, 1997.

5. Hattori, M., N. Tsukamoto, M.S.A. Nur-Kumal, B. Rubinfeld, K. Iwai, H. Kubota, H. Maruta, and N. Minato. Molecular cloning of a novel mitogen-induced nuclear protein with Ran GTPase activating domain that affects cell cycle progression. Mol. Cell. Biol. 15:552-560, 1995.

西村　泰治

1. Tanaka, Y., Ohyama, H., Ogawa, M., Nishimura, Y., and Matsushita, S. Identification of peptide superagonists for a self-K-ras-reactive CD4+ T cell clone, using combinatorial peptide libraries and mass spectrometry. J. Immunol. 162: 7155-7161, 1999.

2. Chen, Y-Z., Lai, Z-F., Nishi, K., and Nishimura, Y. Modulation of calcium response by altered peptide ligands in a human T cell clone. Eur.J.Immunol. 28: 3929-3939, 1998.

3. Matsushita,S., Kohsaka, H., and Nishimura, Y. Evidence for self-and non-self-peptide partial agonists that prolong clonal survival of mature T cells in vitro . J.Immunol. 158: 5685-5691, 1997.

4. Matsuoka, T., Kohrogi, H., Ando, M., Nishimura, Y., and Matsushita, S. Altered TCR ligands affect antigen-presenting cell responses: Up-regulation of IL-12 by an analogue peptide. J.Immunol. 157: 4837-4843, 1996.

5. Chen, Y-Z, Matsushita,S., and Nishimura, Y. Response of a human T cell clone to a large panel of altered peptide ligands carrying single residue substitutions in an antigenic peptide; Characterization and frequencies of TCR agonism and TCR antagonism with or without partial activation. J.Immunol. 157: 3783-3790, 1996.

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