平成１２年度研究計画

研究項目Ａ０１：抗原非特異的分子による情報伝達制御

計画研究ウ：アポトーシスの情報伝達制御

○ 1. 米原　伸：Fasを介するアポトーシス機構と免疫制御(京大・ウイルス研・教授・免疫学)

２．酒巻和弘：ノックアウトマウスによるFasシステムの解析（京都大学ウイルス研究所助教授）

３. 井上純一郎：CD40を介するシグナル伝達機構(東大・医科研・助教授・免疫学)

目的

計画

業績

インパクトファクター

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研究目的

《背景》　外来抗原や自己抗原に対する免疫応答は、増幅できなければ癌・感染症・免疫不全症に陥り、収束できなければ自己免疫疾患・アレルギー疾患等を発症する。免疫反応を収束させる重要な機構としてアポトーシスが存在するが、末梢Ｔ細胞ではFasを介するアポトーシス、Ｂ細胞では抗原受容体からのアポトーシスシグナルとCD40からのアポトーシス抑制シグナルが重要な役割を担っている。そして、Fasの機能不全マウスであるlprマウスは自己免疫疾患や腫瘍を発症し、CD40やCD40Lの点突然変異により重度の免疫不全が発症する。一方、中枢（胸腺）におけるＴ細胞トレランスを担うシグナル伝達系は明らかではない。このようなアポトーシス誘導の細胞間および細胞内シグナル伝達機構を明らかにし、さらにシグナル伝達分子の生理機能を明らかにすることは、免疫系における恒常性の維持機構を正しく理解するために必要であるばかりでなく、免疫系の異常が関与する様々な疾患の理解と治療法の開発に必要不可欠である。

《目的》　◎Fasを介するアポトーシス誘導細胞内シグナルに深く関わる分子FLASHのKOマウスを作成し、その胚発生および免疫系における機能を明らかにする。

◎Fas、FLASH、caspase-8などのＫＯマウスやKO細胞を解析し、細胞内のアポトーシス誘導シグナルと増殖誘導シグナルとのクロストーク機構を分子レベルで明らかにする。

◎ヒト胸腺上皮細胞株が共培養したＴ細胞にアポトーシスを誘導する分子機構を明らかにする。

◎抗原受容体シグナルとCD40シグナルのクロストークによるG1-S移行及びアポトーシス制御機構を解明する。

《特色と意義》　米原はFasを発見した。FasはFADDを介してcaspase-8の活性化を誘導しアポトーシスを誘導する。米原らはcaspase-8の活性化に必須の新規分子FLASHのクローニングに成功した。また、胸腺上皮細胞株を樹立し、これがＴ細胞にアポトーシスを誘導する現象を新たに見いだしている。一方、井上らはCD40のシグナル伝達因子としてTRAF5, TRAF6を同定し、解析を進めている。これらのoriginal研究を背景として、免疫系におけるアポトーシスシグナルを解明することは本研究の特色である。また、この研究結果は、自己免疫疾患・免疫不全症やアレルギー疾患の病因究明や治療法の開発に結びつく意義を有している。

《国内外の状況、位置付け》　本研究に関連する分野は国内外ともに活発に研究されており、最も競争の激しい研究分野である。FasとCD40はアポトーシスの誘導抑制を司る代表的な分子として広く注目されるだけでなく、免疫疾患との関連も証明され、活発に研究されている。申請者らは、世界に先駆けてこの研究分野を開拓しただけでなく、先駆的な研究を展開している。

《他省庁等で実施中の研究との関係》　科学技術庁科学技術振興調整費「FasとFLASHによるアポトーシス誘導の制御機構」（H11年度、￥8,531,000／年）で行っている研究は、FasとFLASHの癌との関連を研究するものであり、免疫系における意義を研究する本研究とは異なっている。

研究計画

米原・酒巻

◎FLASHのKOマウスを作成し、その胚発生および免疫系における機能を解析する。

◎Fas、FLASH、caspase-8などのＫＯ細胞またＥ８のトランスジェニックマウスに由来するＴ細胞の、様々な刺激によるアポトーシス誘導に対する感受性、抗原刺激やIL-2等による増殖能を比較検討する。

◎FLASHのKO細胞にFLASHの変異体を発現させることにより、FLASHのドメインとアポトーシスや細胞増殖との関係を解析する。

◎FLASHに対するモノクローナル抗体を作成し、その細胞内での状態（caspase-8以外の分子との会合）を解析する。

◎そして、細胞内のアポトーシス誘導シグナルと増殖誘導シグナルとのクロストーク機構を分子レベルで解析する。

◎ヒト胸腺上皮細胞株が共培養したＴ細胞にアポトーシスを誘導する分子機構を解析し、その現象に関わる分子を明らかにする。また、その遺伝子KOマウスを作成する。

井上

◎.Cdk4&6とp27Kip-1については、蛋白質の安定性の変化により各々の発現量が制御されていることを現在までに明らかにした。そこで両蛋白質の安定性制御における、ユビキチンープロテオソーム系の関与及びリン酸化の関与について解析する。

◎ Bcl-XLについても昨年度までにmRNAの転写量により発現が制御されていことを明らかにしプロモーター領域のクローニングにも成功した。プロモーター領域上のCD40シグナル標的配列を同定する。

◎ TRAF6遺伝子ノックアウトマウスを作成を完了しCD40シグナルの異常を解析中である。これを継続する。

◎ TRAF5及びTRAF6蛋白質のTRAF-C領域（トランスドミナントネティブに働く）を各々恒常的に発現したトランスジェニックマウスを作成した。このマウスにおけるCD40シグナルの変化を解析中である。

◎ TRAF6遺伝子ノックアウトマウス胎児より線維芽細胞を樹立する。そのTRAF6-/-細胞に種々のTRAF6変異体を発現させシグナル伝達に必要な領域を詳細に検討する。

◎ TRAF5及びTRAF6蛋白質に相互作用する蛋白質を酵母を用いたツーハイブリット法によりスクリーニングする。

研究業績

米原　伸

Yuzuru Imai, Takaharu Kimura, Akira Murakami, Nobuyuki Yajima, Kazuhiro Sakamaki and Shin Yonehara. The CED-4-homologous protein FLASH is involved in Fas-mediated activation of caspase-8 during apoptosis. Nature, 398: 777-785, 1999.

Shin Yonehara. Effects of anti-Fas antibodies on lymphocytes and other organs: Preparation of original and new monoclonal antibodies and amelioration of systemic autoimmune disease. Intern. Rev. Immunol., 18: 329-345, 1999.

Takaharu Kimura, Yuzuru Imai and Shin Yonehara. Reply: Searching for FLASH domains. Nature, 401: 662-663, 1999.

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Hajime Komano, Yuko Ikegami, Minesuke Yokoyama, Rika Suzuki, Shin Yonehara, Yoshiki Yamasaki and Nobukata Shinohara. Severe impairment of B cell function in lpr/lpr mice expressing transgenic Fas selectively on B cells. Int. Immunol., 11: 1035-1042, 1999.

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Shinya Kuroda, Masaki Fukata, Masato Nakagawa, Katsuhiko Fujii, Tomoko Nakamura, Tadashi Ookubo, Ichiro Izawa, Takahiro Nagase, Nobuo Nomura, Hideki Tani, Ikuo Shoji, Yoshiharu Matsuura, Shin Yonehara, and Kozo Kaibuchi. Participation of IQGAP1, a target of the small GTPase Cdc42 and Rac1, in the regulation of E-cadherin-mediated cell-cell adhesion. Science, 281: 832-835, 1998.

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酒巻和弘

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井上純一郎

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