受託サービス

大腸菌の配布で価格は 1 万円/クローンになります。お支払は、四半期ごとに集計をおこない、医学部事務から請求をさせていただきます。

シグマ遺伝子情報検索サイトでターゲット遺伝子を検索し、種別、遺伝子名 (Symbol)、TRC 番号、バリデート情報をご確認ください。
共同研MyPage にログイン後、shRNAライブラリWEB受託ページのレンチウイルス shRNAライブラリ配布 [ ライブラリ検索 ]機能にて希望クローンを選択ください。
財源(空白可能)、遺伝子組換え実験計画書(必須)、受取希望日(必須)についてもご入力後に申し込みください。
「申込実行」の前に必ず注文内容をご確認ください。

ご注文方法の詳細は >こちら(PDF)

通常、受注確認からお渡しまで 1～3日いただきます。
MyPageの「現在の注文一覧」にて受注状況をご確認いただけます。
受注状況は「注文確認中」「注文確認済み」「納品済み」の順番で進みます。
「注文確認済み」の受渡日時(確定)をご確認ください。
受取日時を変更希望の場合は必ずLVstaff@ctrlab.med.osaka-u.ac.jp までご連絡ください。

大腸菌は LB-amp プレートにストリークしたコロニーと、LB-amp 培地の入った 96-well プレートに植菌した状態でお渡しします (50μL、カルベニシリンを用いています, 4℃)。 プレートは通気性のシールを貼った状態です。
MyPage「現在の注文一覧」に記載の受渡日時に共同研究棟7階管理室(D71-03)までお越しください。

(1) 試料、 (2) クローン分配表、(3) 納品書、(4) カルタヘナ誓約書をお渡しいたします。
カルタヘナ誓約書はその場でサインをしていただきます。

試料は二重に包装して持ち運びください。 プレートが入る取っ手のついた容器 (フリーズボックスなど) をお持ちいただくと持ち運びが便利です。

本製品は「遺伝子組換え生物等の使用等の規制による生物の多様性の確保に関する法律 (通称カルタヘナ法)」の使用規制対象品となります。

ご使用に際しては、規制に即し適切にお取り扱い下さい。 詳細はカルタヘナ法法規関連資料をご参照ください。

医学部内では大腸菌は P1 レベル, 組換えウイルス作製は P2 レベルになります。その他の学部では施設管理者の方にご確認ください。 大腸菌の配布にあたり、ベクター「 pLKO 誘導体」について P1レベル での遺伝子組換え実験申請をしている必要があります。 まだ申請されていないラボでは、追加変更申請をお願いいたします。P2 レベルに関しては、利用される組換えウイルスの手法に添った内容を申請ください。

【ノックダウン効率の確認手順】
以下のURLへアクセスしてください。
https://www.sigmaaldrich.com/JP/ja/semi-configurators/shrna
検索窓にTRC番号（TRCN...）を入力し検索します。
表示されたリストの「バリデーション」欄が「検証済み」となっているものは、右側の「詳細」をクリックすることで、実際の数値（％）を確認いただけます。

約 30% の 80,000 クローン, 17,000 遺伝子ターゲットについてバリデーションが完了しております (2013 年 3 月現在 シグマ社)。

エンベロープタンパク質を VSV-G に置換したレンチウイルスを利用することにより、幅広い細種に感染可能です。 また、shRNA をゲノム配列に組込むことにより、長期間の安定的なノックダウンが可能です。

ヒト 18,831 遺伝子 (108,635 クローン), マウス 18,445 遺伝子 (90,495 クローン) のライブラリーをコレクションしています。 TRC Ver.1 / 1.5になります。各ターゲット遺伝子につき 2〜20 クローンずつ利用可能です。

詳細は>こちらをご覧ください。

プレデザインshRNAの詳細は >こちら から検索いただけます。

シグマ社の shRNA の配列デザインは以下のとおりです。

(Dicer で切断される領域)

[ヘアピンのループ構造]

(CCGG) -sense- [CTCGAG] -anti-sense-(TTTTTG)

「sense」の部分の配列が標的遺伝子の、どこに該当するかを検索していただければ切断箇所が分かります。

遺伝子リストのファイルはご用意しておりません。シグマ社遺伝子情報検索サイトにて検索してください。

Gene ID., Gene Symbol, RefSeq ID などで検索可能です。

The RNAi Consortium の略で、ハーバードメディカルスクール, マサチューセッツ工科大学, やノバルティス, イーライ・リリー, シグマアルドリッチなどの企業をふくめ、 世界的な研究機関で構成されております。

詳細は>こちらをご覧ください。

TRC1 は pLKO.1-puro ベクター骨格を有したライブラリーです。

TRC1.5 は TRC1 と同じベクター骨格を使用していますが、シグマ社オリジナルのライブラリーで、 他社では販売しておりません。

TRC2 は共同研では配布していませんが、pLKO.1-puro ベクターに WPRE (the Woodchuck Hepatitis Post-Transcriptional Regulatory Element) を追加した新しいベクター骨格を有したライブラリーです。

詳細は>こちらをご覧ください。

野生型の HIV は、ウイルスのエンベロープタンパク質 gp120 が宿主細胞膜表面の CD4+ ケモカインレセプターに結合するため、CD4+ ケモカインレセプターの細胞のみ感染できます。

それに対して組換え HIV である Mission shRNA レンチウイルスはエンベロープタンパク質を VSV-G に置換することで、広域の宿主細胞に感性性を持っています。また、非分裂細胞にも利用できます。

大阪大学のみのライセンスになります。他大学への譲渡等はできません。また、知的所有権については研究目的では問題がございません。

TRC1 でヒト遺伝子の場合は 『MISSION TRC-Hs1.0』, マウス遺伝子の場合は 『MISSION TRC-Mm1.0』 と明記して下さい。 この記述で 『MISSION shRNA の TRC Ver.1.0』 という意味になります。

TRC1.5 の場合は末尾を 『1.5』 としてください。

また、謝辞に 『共同研究実習センター』 の名前を記載いただけると幸いです。

あります。

TRC1 (/1.5) と TRC2 の違い, 各コントロールベクター, パッケージングプラスミド, カスタム用 MISSION shRNA ベクターコレクションなど詳細情報がございます。

DH5α-T1R (GC5株) を使用しています。

MISSION shRNA はレンチウイルスのみのご提供となります。

MISSION shRNA 導入のネガティブコントロール用として、non-target shRNA がお勧めです。 non-target shRNA はヒト, マウス遺伝子と 4bp 以上のミスマッチがあるため、ヒトおよびマウスのどの遺伝子発現もノックダウンしません。

プラスミドは (TRC1: 製品番号 SHC002, TRC2: 製品番号 SHC202)

レンチウイルス粒子は (TRC1: 製品番号 SHC002V, TRC2: 製品番号 SHC202V) をシグマにて販売しております。

コントロールの詳細は>こちらをご覧ください。

MISSION shRNA のノックダウン効率確認のポジティブコントロール用として、既に発現している TurboGFP をノックダウンする製品がございます。

TurboGFP ノックダウン用 shRNA プラスミド (TRC1: 製品番号 SHC004, TRC2: 製品番号 SHC204)

TurboGFP ノックダウン用 shRNA レンチウイルス粒子 (TRC1: 製品番号 SHC004V, TRC2: 製品番号 SHC204V) を販売しております。

これらの shRNA が導入された細胞は、既に発現している緑色の蛍光が消失します。

コントロールの詳細は>こちらをご覧ください。

MISSION shRNA 導入のコントロール用として

TurboGFP 発現用プラスミドは (TRC1: 製品番号 SHC003, TRC2: 製品番号 SHC203)

TurboGFP 発現用レンチウイルス粒子は (TRC1: 製品番号 SHC003V, TRC2: 製品番号 SHC203V) をシグマにて販売しております。

これらの shRNA が導入された細胞は緑色の蛍光を発します。

コントロールの詳細は>こちらをご覧ください。

目的に応じた蛍光をご選択ください。

各蛍光波長、製品との対応表、 詳細は>こちらをご覧ください。

共同研では用意はございませんが、シグマでは様々なタイプのライブラリーが販売されています。

詳細は>こちらをご覧ください。

共同研では用意はございませんが、シグマでは、ヒト 21 種類, マウス 3 種類の遺伝子ファミリーセットがご利用可能です。

遺伝子ファミリーセットは>こちらをご覧ください。

※遺伝子ファミリーセットの遺伝子リストは開示しておりません。

基本的なプロトコールについて、まずは>こちらをご覧ください。

基礎データの詳細はMISSION Application Dataをご参照ください。

human U6 promoter (pol III promoter) を導入しております。

TRC 1, TRC 1.5 には WPRE 配列は含まれておりません。TRC 2 には shRNA 発現を安定化するために WPRE 配列を含んでおりますが、共同研ではご用意しておりません。

細胞種によりウイルスへの耐性が異なるためです。細胞種ごとに毒性がないウイルス濃度を、細胞生存曲線を作成して見極める必要があります。

MOI は 1 細胞あたりに導入されるレンチウイルスパーティクルの数を示しています。 新しい細胞系にレンチウイルスを導入する場合は、使用する各細胞系で効率的な導入に必要なレンチウイルスの最適な量を知る必要があります。 幾つかの MOI で実際にテストする事が強く推奨されます。異なる MOI 値で細胞の生存曲線を作成してご確認下さい。

詳細はこちらをご参照ください。

高タイター作製プロトコールはこちらをご参照ください。

レンチウイルスのエンベロープタンパク質である p24 の測定を行っております。p24 titer assay (ELISA 法) を用いております。

詳細はこちらをご参照ください。

必要なウイルスは使用する細胞により異なるため、正確な回数はご回答できかねます。 たとえば HeLa や HEK293T の場合、約 50 回分の実験が可能です。 (96-well plate, 〜16,000 cells) primary cell など、遺伝子導入が困難な細胞はさらに多くの量が必要となります。 詳細はこちらをご参照ください。

シグマ社のレンチウイルスパッケージングミックスプラスミド DNA をご利用ください。 製品番号SHP001です。

MISSION ウイルス粒子は自己増殖に必要なアクセサリー遺伝子を除去しているために増殖いたしませ。そのため、レンチウイルス粒子を再増殖して使用することはできません。

レトロウイルス用のパッケージングプラスミドでは、作成できません。ウイルス作製に必要な遺伝子が同じ名前でも、レンチウイルスとレトロウイルスでは配列が異なります。

レンチウイルス粒子はあまり安定ではないため、基本的に RNA を抽出する工程でレンチウイルス粒子は不活性化されます。 フェノールを含む試薬はレンチウイルス粒子を不活性化します。それ以外の方法でも cell lysate を調整するような RNA 抽出方法であれば、やはりレンチウイルス粒子は不活性化されます。

shRNA レンチウイルスパーティクルは、一度解凍した後に再凍結して保存する事は可能です。 ただし、凍結融解の繰り返しはウイルス粒子の活性を著しく低下させるため、一度解凍した後は分注保存が適当です。 解凍は室温で容器を水につけて行い、直ちに氷上に移します。4℃ などではウイルス粒子は徐々に活性が低下し、24 時間程度しか活性が維持されない可能性があります。 可能な限り早く再凍結する必要があります。また、ウイルス粒子は遮光状態でお取り扱いください。

特にウイルス濃度を高める必要がある場合は、以下の論文を参考にしてください。

Geraerts, M., et al, Upscaling of lentivirus vector production by tangential flow filtration. J. Gene Med., 7, 1299-1310 (2005).

細胞種によります。通常使用しているプロトコールで問題ありません。

共同研ではプラスミドでの配布はしておりません。エンドトキシンについては、測定しておりません。

ウイルスベクターは抽出および精製が困難であることが知られています。 抽出にはエンドトキシン除去が可能な GenElute Endotoxin-Free Midiprep Kit (製品番号 PLED35) または GenElute HP Endotoxin-Free Plasmid Maxiprep Kit (製品番号NA0400S、NA0400、NA0410) 等をお勧めします。

さらに、一般的な方法として Mission shRNA プラスミドの収率をあげるための対処法として以下の方法がございます。

大腸菌株 GC5, GC10, HB101, DH10, DH5 を使用する。

抗生物質として Carbenicillin (例: Sigma 製品番号 C3416) を使用する。

Maxiprep を行う。

大腸菌の密度を最大にする。